力學刺激下Wnt信號通路在促進成骨分化中作用的研究進展

吳玉瓊 綜述 房兵 江凌勇 審校

·綜述·

力學刺激下Wnt信號通路在促進成骨分化中作用的研究進展

吳玉瓊 綜述 房兵 江凌勇 審校

Wnt信號通路在骨形成過程中發揮重要作用，主要表現為對骨組織中成骨分化等功能的調節。研究表明，激活Wnt信號可增強成骨特異性基因的表達，促進骨形成；機械力學刺激在促進骨骼的發育及維持良好的骨骼形態方面具有關鍵作用。本文就Wnt信號通路參與力學刺激下骨向分化的調節進行綜述。

Wntβ-連環蛋白成骨分化機械應變

Wnts是一類參與到細胞生物進程（如胚胎發育、骨骼形成及腫瘤發生等）的蛋白家族。Wnt信號通路在進化上高度保守，從線蟲、果蠅到高等脊椎動物中都發現了該通路的存在。很多研究表明，Wnt信號通路在細胞分化與增殖過程中起重要作用。本文就Wnt信號通路在機械力學刺激下骨向分化中的作用進行綜述。

1 Wnt信號通路概述

Wnt基因是鼠類乳腺癌病毒誘導的小鼠乳腺癌中克隆出的一種原癌基因，由Nusse等[1]報道并稱為int-1基因，與1973年Sharma報道的果蠅的無翅基因Wingless（wg）為同源基因，故將兩者合并命名為Wnt。目前，發現Wnt蛋白家族至少有19種分泌型糖蛋白，根據其轉導信號的差異，將Wnt信號轉導途徑分為經典Wnt信號通路、Wnt/PCP通路（planner cell polarity pathway）和Wnt/Ca2+通路。

1.1 經典Wnt信號通路

經典Wnt信號通路又稱β-catenin依賴性通路，該通路是由Wnt糖蛋白與分泌型卷曲蛋白受體（Secreted Frizzledrelated proteins，sFRP）和低密度脂蛋白受體相關蛋白（LRP）-5/6的結合而被激活的。sFRP為細胞膜表面的一類具有7次跨膜結構的受體蛋白，與細胞表面的另一類單跨膜蛋白LRP-5/6受體共同組成配體Wnt的特異結合靶點。

在無Wnt信號的情況下，細胞質內的β-catenin和大腸腺瘤息肉蛋白（APC）、骨架蛋白Axin、酪氨酸激酶（Casein kinase，CK）-1和糖原合成激酶（GSK-3β）形成一個多蛋白的β-catenin降解復合物，其中的CK-1和GSK-3β可將βcatenin氨基端Ser/Thr磷酸化[2]，使得胞質內的β-catenin維持在較低的濃度，Wnt信號通路處于關閉狀態。

當外界環境改變，誘導Wnt大量生成時，Wnt與sFRP及LRP-5/6的特異結合能夠激活細胞內含有PDZ結構域的散亂蛋白（Dishevelled，Dvl），Dvl釋放信號抑制GSK3對β-catenin的降解活性，導致大量的β-catenin在胞漿中穩定積累，并進入細胞核內激活淋巴增強因子（Lymphoid enhancerbinding factor，LEF）與T細胞因子（T cell-specific factor，TCF）的轉錄活性，啟動靶基因轉錄，如c-myc、cyclin D1等的表達，促進細胞增殖和活化[3]。該通路的Wnt蛋白有Wnt1、Wnt3a、Wnt8a、Wnt10b等。

1.2 非經典Wnt信號通路

Wnt/PCP通路和Wnt/Ca2+通路因不通過β-catenin積聚的方式發揮作用，所以又稱為非經典Wnt信號通路，它包括Wnt5a、Wnt7a和Wnt11等蛋白。前者是通過激活小G蛋白、Jun N-末端激酶（JNK）和Rho激酶，促進肌動蛋白骨架的變化；后者是在Wnt5a等與FZ受體結合后，使細胞質內的G蛋白分解為3個亞單位，α、β和γ。Gα激活磷酸二酯酶，抑制細胞內周期性的CGMP活化。Gβ/γ復合體激活磷脂酶C，將4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP-2)水解為IP3和DAG，IP3增加細胞內鈣水平，激活神經鈣蛋白和活化各種依賴鈣離子的蛋白，從而引起細胞內的生物效應，調節細胞代謝活動。神經鈣蛋白通過激活TCF，負性調節β-catenin依賴性通路或刺激細胞遷移[4－5]。

對Wnt信號通路的研究結果已有所改變。曾有文獻報道，經典和非經典Wnt通路通路可促進人骨髓基質干細胞增殖，抑制成骨分化[7]。近期的研究提示，Wnt可直接影響多潛能的前體細胞向成骨細胞分化的過程。穩定表達Wnt1、Wnt3a可促進C3H10T1/2（小鼠胚胎間充質干細胞系）的增殖，增強成骨細胞早期分化標志物堿性磷酸酶(ALP)的分泌活性，其他與成骨細胞分化相關的標志，如Runx2、骨鈣素和Ⅰ型膠原蛋白等卻基本不受影響[8]。這說明Wnts能促進前體成骨細胞的生長和成骨細胞的早期分化。

2 機械刺激對Wnt信號通路在成骨分化中的調控作用

骨骼系統的主要功能是為生物體的活動提供穩定的支架，它時刻承擔著生物體運動所形成的載荷。目前，系統研究力學刺激對骨細胞的作用是建立在體外特定裝置下細胞培養基礎上的。

2.1 體外生物力學裝置

研究機械刺激對骨細胞的作用機制，關鍵在于創建一種體外細胞受力裝置，可較好地模擬體內細胞所處的生物力學微環境。目前，常見的體外力學裝置可分為流體剪切應力系統、張應力系統、靜壓應力系統等。

骨組織在載荷狀態下，會在組織間隙內產生液體的流動（Interstitial fluid flow，IFF）[9]。當施以外力時，液體從高應變區流向低應變區，骨組織中的各類細胞就持續地暴露于這種由于液體流動而造成的剪切應力中。采用分子示蹤技術發現，載荷誘導的IFF是維持骨細胞代謝和骨組織塑形所必須的條件。張應力系統通過對培養基的作用來達到對黏附細胞的牽張作用，以模擬體內牽張力通過細胞外基質傳遞到骨細胞的現象。流體靜壓力模型包括正性壓力模型和負性壓力模型（利用真空的抽吸作用），一直被用作組織或細胞感受壓力刺激的研究。

體外加力裝置多種多樣，刺激強度、頻率和作用時間等都將對細胞的增殖和分化產生不同的影響，能真實地模擬體內細胞所處的生物力學微環境，并導致細胞產生相應的生物學改變。

2.2 機械力刺激成骨過程中的Wnt通路

Arnsdorf等[9]通過對β-catenin的轉位誘導和Wnt蛋白表達的檢測，發現潛在的機械刺激可調節小鼠骨髓間充質干細胞來源C3H10T1/2中的Wnt經典和非經典信號通路。免疫染色等技術也證實，流式應力誘導β-catenin在核內積聚，促進TCF/LEF基因表達，并上調Wnt相關蛋白的表達。在機械誘導的成骨分化中，β-catenin和Wnt5a都可上調Runx2的表達。其中，Wnt5a在Runx2的表達上調中是必須的，并決定酪氨酸受體激酶Ror2是否參與。此外，通過對調控β-catenin信號和入核的分子進行檢測，發現合并Ror2和RhoA的非經典Wnt5a信號及N-鈣粘蛋白調節β-catenin信號對機械誘導成骨分化是非常必要的。

骨保護素（Osteoprotegerin，OPG）作為RANKL的拮抗受體，可抑制破骨細胞形成及骨吸收。Yu等[10]的研究發現，機械拉伸力可促進C2C12細胞中的骨保護素穩定表達，成骨標記基因骨鈣素和ALP的表達在牽拉24 h后呈現短暫下降，在48 h后重新回到正常水平。阻斷非經典Wnt通路時，骨保護素的表達受到明顯抑制，并且機械拉伸誘導的骨保護素的形成可能抑制破骨細胞（由骨髓巨噬細胞分化而來）的形成，而經典Wnt通路并無此作用。因此，他們認為機械拉力是通過非經典Wnt通路來上調骨保護素的表達以促進骨的改建。

Liedert等[11]發現應力導致活性β-catenin水平上升，促使其在核內積聚，增加骨橋素啟動子TCF/LEF轉錄活性。雌激素受體（Estrogen receptor，ER）抑制劑ICI和他莫西芬可抑制ROS 17/2.8細胞中LiCl誘導性的β-catenin核內定位和活化，但在敲除ER后，對大鼠細胞加力，Wnt相關基因表達下降。同時，機械壓力也可通過抑制β-GSK3，進一步調節多種下游效應子以調控間充質干細胞的分化[12]。

Jansen等[13]觀察發現，在機械牽拉誘導成骨最初15 min時，β-catenin在核內開始積聚，但在12 h、40 h后急劇下降。并且，Wnt信號通路與ERK信號通路在機械負荷下促進成骨的過程是兩個獨立的過程。

2.3 成骨分化中的Wnt信號通路

Wnt蛋白與細胞膜表面的LRP-5/6結合后，誘導其磷酸化，進而與Axin結合，再和β-catenin-AXIN-APC-GSK3復合體結合。Liu等[14]運用Axin2缺陷模型進行研究時發現，Axin2具有調控細胞內β-catenin分布的作用。當Axin缺失時，β-catenin在成骨祖細胞核內大量堆積，β-catenin與核內的LEF/TCF轉錄子結合，促進成骨轉錄；當Axin2未被敲除時，β-catenin結合到胞質的Axin依賴性降解復合體中，成骨中斷。這也說明β-catenin在細胞內的不同定位可調節顱骨成骨細胞的發育。Axin2的缺失所誘導的BMP信號通過調節β-catenin在核內外的遷移促進成骨分化。但是，β-catenin單倍體的缺陷卻可減少由于Axin2缺失所引起的頭顱異常。

Zhou等[15]的研究進一步證實，經典Wnt信號通路在干細胞早期分化方向上起重要作用。Wnt1、Wnt3a可誘導C3H10T1/2成骨細胞早期標志物堿性磷酸酶（ALP）的活性。Wnt1和Wnt10b可抑制脂肪細胞的分化，Wnt3a可抑制脂肪細胞標記物PPARr2和FABP（脂肪酸結合蛋白）在C3H10T1/2細胞中生成，促進C3H10T1/2分化為成骨細胞。另有研究證實，Wnt信號可刺激早期成骨細胞分化，卻抑制成熟成骨細胞的礦化。此外，成骨分化可抑制內源性Wnt信號，改變多種Wnt信號轉導相關基因的表達[16]。

另外，Wnt5a已被證明在骨髓間充質細胞中是通過降低PPARγ誘導性的脂肪形成來誘導成骨的。類似的實驗也證明，Wnt5a+/-小鼠的成骨細胞會出現一定數量減少，并且骨量也相應減少，而骨髓的脂肪細胞卻增加。有報道認為，非經典Wnt通路通過招募抑制性組氨酸甲基，使染色體失活而抑制PPARγ的功能[17]。

3 Wnt相關因子

3.1 LRP

LRP5和LRP6基因屬于低密度脂蛋白受體（LDLR）超家族，主要功能為維持體內膽固醇的穩定和介導脂蛋白酶等大分子的細胞內吞作用。近來發現LRP分子尤其是LRP5的變化與骨量和成骨細胞功能密切相關。Gong等[18]對骨質疏松-假性神經膠質瘤綜合癥（Osteoporosispseudoglioma syndrome，OPPG）進行定位候選克隆分析，證實LRP5基因突變導致OPPG。Little等[19]報道了因LRP5基因的第3外顯子有一堿基發生點突變(A－T)，導致了高骨量表型。說明LRP5基因的不同突變類型可導致兩種截然相反的結果，即功能喪失性突變可以導致骨量減少，而功能獲得性突變能夠使骨量增高。

近來的研究發現，在敲除LRP5的小鼠中，腸道特異性LRP5的缺失將導致骨量減少。LRP5抑制Tph1表達，Tph1可限制十二指腸腸嗜鉻細胞中血清素合成酶的合成速率。降低血液中血清素（血清素是通過Htr1b和CREB來抑制成骨細胞增殖的）水平可使LRP5缺陷小鼠的骨形成及骨量恢復正常。再者，腸道特異性LRP5的活化或Tph1的失活，將導致骨量增加，并可預防卵巢切除后雌激素分泌減少所致的骨質流失[20]。

3.2 sFRP

分泌型卷曲相關蛋白（Ecreted Frizzled-related proteins，sFRPS）是Wnt在細胞表面的受體，目前已發現10個成員，其蛋白結構含有7個跨膜片段受體和富含半胱氨酸的N-末端，它們都擁有KTxxxW區域，并通過該區域介導Wnt信號。Cho等[21]研究了不同sFRP成員對成骨細胞前體細胞分化和成骨細胞凋亡的作用，發現C3H10T1/2細胞中不同劑量的sFRP-2和sFRP-4均可使Wnt3a誘導的ALP活性增加，而sFRP-1、sFRP-3卻無此作用。逆轉錄誘導sFRP-2可使維生素C和ALP活性增加。sFRP-3可增加依托泊苷誘導的MC3T3-E1鼠的成骨細胞凋亡。

3.3 TCF/LEF1

TCF/LEF1轉錄因子是經典的Wnt信號細胞核內的效應器，是Wnt依賴信號途徑控制細胞生長和死亡的靶點，含有高遷移基團框的轉錄因子。β-catenin與TCF/LEF1的結合受TCF-結合蛋白（包括NLK和CBP）的負性調控。在經典Wnt信號通路未被激活的情況下，TCF/LEF1會與轉錄輔阻遏物（如CtBP、TLE）和組蛋白脫乙?；赶嗷プ饔茫藘鹊摩耤atenin可替代這些輔阻遏物，結合在TCF/LEF1氨基末端，增強和染色質的相互作用，重新恢復輔催化劑，利于基因表達[22]。并且，TCF在Runx2啟動子上有一個活性結合位點，這提示β-catenin/TCF/LEF復合體可直接調節Runx2的表達[23]。

3.4 Dkk

Dkk（Dickkopfs）是分泌性的糖蛋白，人類基因組中包括Dkk1～4。Dkk1和Dkk4可能抑制Wnt信號，Dkk2作為Wnt信號的激動劑或拮抗劑，而Dkk3對Wnt通路沒有影響。Dkk與其跨膜受體Kremen結合，并直接結合LRP－5/6形成三聚體后內化，從細胞膜上除去LRP，抑制Wnt信號通路。Wang等[24]研究發現，去卵巢大鼠Dkk1反義寡核苷酸處理組破骨細胞刺激因子RANKL表達下降，破骨細胞分化受抑制，破骨細胞減少，成骨細胞數量增加。Kido等[25]對9周齡大鼠施加機械應力，發現機械應力可刺激ΔFosB/JunD復合物結合到IL-11基因啟動子的AP-1位點，進而IL-11通過抑制Dkk2的表達進而活化Wnt/β-catenin信號通路促進成骨分化。

4 展望

Wnt信號通路的發現及其在骨向分化中的研究進展，為我們闡明了骨骼發育機制的新進展，雖然其在力學刺激下具體的轉導過程尚不明確，但相信進一步的研究將會為人類在治療骨代謝方面的疾病，如骨質疏松及骨骼改建等方面，提供新的治療思路和治療方法。

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The Role of Wnt Signaling Pathway on the Process of Mechanically Induced Osteogenic Differentiation

Wnt;β-catenin;Osteogenic differentiation;mechanicial stress

Q813.1+1

B

1673－0364（2011）03－0168－04

WU Yuqiong,FANG Bing,JIANG Lingyong.
Orthognathous and Orthodontic Treatment Center,Department of Oral and Maxillofacial Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai Key Laboratory of Stomatology,Shanghai 200011,China.Corresponding author:FANG bing(E-mail:braces_dr@hotmail.com).

2011年3月6日，

2011年4月30日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.03.014

國家自然科學基金項目（30901698，10972142），上海市科學技術委員會項目（08411961600）。

200011上海市上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院口腔頜面外科正頜正畸治療中心，上海市口腔醫學重點實驗室。

房兵（E-mail:braces_dr@hotmail.com）。

【Summary】Wnt protein family play an important role in the skeletal growth,mainly in the regulation of osteogenic differentiation in bone tissue.It has been shown that the activation of Wnt signaling could promote the expression of osteogenic-special genes and induce bone formation.Mechanical stimulation plays a vital role in promoting bone development and maintaining skeletal feature.This paper will summary the research progress of Wnt signaling pathway in mechanically induced osteogenic differentiation.