紫杉醇對鼻咽癌細胞放療增敏作用的研究

楊永凈,劉士新,刁建東

(1.吉林省腫瘤醫院 放療二科,吉林 長春 130012;2.吉林大學中日聯誼醫院 腫瘤血液科,吉林 長春 130033）

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma）是我國常見的惡性腫瘤之一,在頭頸部惡性腫瘤中占首位。放射治療是鼻咽癌的主要治療手段,但鼻咽癌的放療療效受腫瘤細胞放射敏感性的限制。近年的研究表明,腫瘤細胞的放射敏感性與細胞在增殖周期各時相的分布密切相關,因此本研究選擇具有細胞周期阻滯效應的紫杉醇與放射治療聯合應用,以探討其對細胞放射敏感性的影響及其可能機制。

1 材料和方法

1.1 細胞株、藥物和試劑人鼻咽癌CNE細胞株購自中國科學院上海細胞庫。紫杉醇為山西普德公司產品。噻唑藍(MTT）、二甲基亞砜(DMSO）購自Sigma公司,RPMI-1640、胰蛋白酶購自GIBCO公司,胎牛血清購自天津TBD公司。

1.2 細胞及培養條件人鼻咽癌細胞培養于含有10%胎牛血清的PRMI-1640培養基中,37℃,5%CO2條件下常規培養。

1.3 MTT法測定藥物IC50及IC10值鼻咽癌細胞按5×103/孔的密度接種于96孔培養板,待貼壁生長至對數生長期時,加入稀釋后的紫杉醇,使其終濃度依次為 10-5、10-6、10-7、10-8、10-9μ mol/ml。每一濃度設3復孔,并設正常對照孔及空白調零孔。置37℃培養箱孵育24 h后,棄去藥物及陳舊培養基,每孔加新鮮配制的MTT(5 mg/ml）20 μ l再次孵育4 h,棄去MTT 液,每孔加DMSO 200 μ l,酶聯免疫檢測儀于490 nm波長測定吸光度(A490）。選擇抑制率約為10%的藥物濃度為亞細胞毒劑量濃度。腫瘤細胞抑制率=(對照組A值-實驗組A值）/對照組A值×100%

1.4 MTT法檢測紫杉醇對放療的增敏作用將對數生長期的細胞隨機分為四組:細胞對照組(不進行藥物處理,給予等體積PBS）;單純照射組(細胞以6 Gy劑量進行照射）;單純紫杉醇用藥組(細胞加入亞細胞毒劑量紫杉醇）;照射聯合紫杉醇組(細胞加入亞細胞毒劑量紫杉醇后,以6 Gry劑量進行照射）。將培養的腫瘤細胞以5×103/孔的濃度接種于96孔培養板,按上所述對各組細胞分別進行處理,24 h后倒置顯微鏡觀察細胞增殖抑制情況;同時MTT法檢測各孔在490 nm處的光吸收值(A490）,按公式計算各組抑瘤率。

1.5 流式細胞分析同上將腫瘤細胞以5×103/孔的濃度接種于96孔培養板,按分組分別進行相應處理,24 h后胰酶消化,各組收集細胞2×106個。70%冰乙醇固定,PI染色后流式細胞儀分析細胞周期及凋亡情況。

2 結果

2.1 MTT法檢測紫杉醇對放療的增敏作用結果顯示隨著紫杉醇濃度的增加,細胞存活率降低,呈現明顯劑量依賴性關系。本實驗中選擇濃度10-8 μ mol/ml為亞細胞毒劑量進行給藥。

如前述對細胞分別進行單純照射、單純紫杉醇用藥、照射聯合紫杉醇用藥處理,結果可見,與對照組相比,亞細胞毒劑量紫杉醇用藥組細胞體外增殖活性抑制不明顯,單純照射組及照射聯合紫杉醇組細胞抑制率均高于空白對照組,且照射聯合紫杉醇組高于單獨照射組。MTT檢測,細胞抑制率分別為10.8%,30.4%和45.5%。鼻咽癌對放療敏感,而紫杉醇可進一步增強腫瘤細胞對射線的敏感度。

2.2 不同處理對細胞周期和細胞凋亡的影響不同實驗組細胞處理24 h后,進行流式細胞檢測,結果顯示單純照射組、單純紫杉醇用藥組、照射聯合紫杉醇組均出現不同程度凋亡,其中單純照射組高于單純紫杉醇用藥組,照射聯合紫杉醇組顯著高于單純照射組和單純用藥組。單純照射6 Gy引起的阻滯以G2/M期為主;紫杉醇聯合照射可進一步誘導G2/M期阻滯。

3 討論

放射治療為鼻咽癌的主要治療手段,早期病人單純放療效果較好,但因其發生部位隱蔽,癥狀多樣性,就診病人70%為Ⅲ期、Ⅳa期的局部晚期病人,單純放療療效較差,局部復發和遠處轉移為常見的失敗原因。為提高局部晚期鼻咽癌的治療效果,局部放療和全身化療相結合成為國內外研究的熱點。臨床試驗結果顯示以DDP和5-Fu為基礎的誘導化療提高了局部晚期頭頸部癌放療的效果,同時放化療具有兩種細胞毒作用同時疊加,縮短總療程時間的優勢,一些化療藥物還有放射增敏作用,試驗結果顯示其療效優于序貫化放療[1]。

紫杉醇(Tatol,paclitaxel）是近年來研究開發的化學結構新穎、作用機制獨特的新型抗腫瘤藥物[2]。它可促進微管雙聚體裝配成微管,并阻止微管蛋白解聚,使微管穩定,從而阻礙細胞分裂,使其發生凋亡,達到抑制腫瘤細胞的生長。該物在卵巢癌、非小細胞肺癌和乳腺癌治療中顯示了良好的療效;在頭頸部腫瘤中也具有很好的單藥有效性[3,4]。近期研究表明紫杉醇對包括頭頸部癌在內的一系列細胞系具有明顯的放射增敏作用[5]。其獨特的放射增敏機制表現為G2/M期細胞周期阻滯、誘導細胞凋亡和促進腫瘤細胞再氧合[6,7],而處于G2/M期細胞周期的腫瘤細胞對放療敏感。

本研究結果顯示照射聯合紫杉醇組腫瘤抑制率顯著提高,流式細胞檢測紫杉醇則可將細胞周期阻滯于G2/M期,與文獻報道相符。紫杉醇與放療協同作用后,顯著阻滯了細胞的總細胞周期進展,從而明顯增強了抑制腫瘤細胞生長和誘導凋亡的作用,大大提高了腫瘤細胞對放療的敏感性。實驗研究結果表明紫杉醇與放療聯用,可顯著提高腫瘤細胞的放射敏感性,而其對細胞周期的影響可能是提高細胞放射敏感性的機制之一。

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