先天性顱鎖骨發(fā)育不全家系基因診斷探討

高 超 宋麗佳

鄭州市兒童醫(yī)院康復(fù)中心一區(qū) 鄭州 450053

鎖骨顱骨發(fā)育不全(Cleidocranial dysplasia,CCD)是一種少見的全身性骨發(fā)育障礙及骨—牙形成障礙性疾病,呈常染色體顯性遺傳,該病病理上主要表現(xiàn)為膜內(nèi)成骨障礙,同時(shí)也可存在軟骨發(fā)育障礙,臨床上表現(xiàn)為囟門不閉合或閉合延遲、鎖骨成骨不良、牙齒發(fā)育不全和侏儒等,病變可累及人體所有的膜內(nèi)化骨和軟骨內(nèi)化骨的骨骼。本研究應(yīng)用基因檢測(cè)的方法對(duì)兩個(gè)中國(guó)人CCD不全家系進(jìn)行基因診斷,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 受試者來(lái)自經(jīng)過(guò)詳細(xì)的遺傳病學(xué)調(diào)查、臨床和放射學(xué)檢查得到明確診斷的兩個(gè)CCD家系[1]。家系1中有2名男性受累,先證者1歲6個(gè)月,父親27歲,2例患者身材均較同齡人矮小,頭面部比例失調(diào),頭大面小,眼距增寬,鼻梁塌陷,雙肩在胸前不同程度地靠攏。父親前囟未閉,身高150 cm,兒子前后囟均增大,前囟4 cm×4 cm,顱縫增寬以矢狀縫明顯,未出牙,喉軟骨發(fā)育不全,鎖骨短小,雙肩下垂,肩關(guān)節(jié)活動(dòng)度增大,胸部呈雞胸。家系2中3名女性和2名男性受累,先證者1歲,前囟未閉,未出牙,鎖骨短小,雙肩下垂,肩關(guān)節(jié)活動(dòng)度大;其母親25歲,前囟近閉,身材矮小,眼距增寬,鼻梁塌陷,出現(xiàn)多個(gè)多生牙。兩個(gè)家系中的4位健康成員和50位無(wú)關(guān)健康人作為對(duì)照。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取:經(jīng)受試者知情同意,共收集兩個(gè)家系4例患者、4位健康成員及50位健康體檢人員外周血,乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝。采用小量外周血白細(xì)胞基因組DNA快速抽提純化試劑盒(大連寶生物有限公司),取全血1 mL提取基因組DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增:合成7對(duì)寡核苷酸引物,對(duì)CCD致病基因RUNX2的7個(gè)編碼外顯子及其相鄰的內(nèi)含子序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增[2]。50μ L反應(yīng)體系:上下游引物各2 μ L(濃度5 pmol/L),2×Taq PCR MasterMix 25 μ L(0.1U Taq Polymerase/μ l,500μ M dNTP,20 mM Tris-HCL,100 mM 氯化鉀,3 Mm氯化鎂;北京天根生化科技有限公司),模板DNA適量(約100 ng),滅菌超純水補(bǔ)足體積。由于外顯子1的擴(kuò)增序列中GC含量高,其PCR反應(yīng)體系中又加了終濃度為6%的二甲基亞砜(DMSO)。反應(yīng)條件94℃5 min;94℃30 s,55～65℃梯度退火60 s,72℃30 s,循環(huán)32次;72℃5 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物純化及測(cè)序:PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后,在紫外燈下切取目的DNA條帶,純化回收,純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向直接測(cè)序。

2 結(jié)果

將RUNX2的7個(gè)編碼外顯子的測(cè)序結(jié)果與正常序列進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)家系1中父子兩個(gè)患者外顯子1的346處正反向測(cè)序均顯示T/A雜合雙峰,而該家系健康者和正常對(duì)照測(cè)序中未見這種改變,表明患者發(fā)生了c.346T→A的雜合突變。該突變導(dǎo)致 RUNX2第116位氨基酸的密碼子TGG被AGG取代,從而使其編碼的色氨酸變成精氨酸,即W116R。家系2兩個(gè)受試患者外顯子3正反向測(cè)序都在610處顯示A/T雜合雙峰,即患者出現(xiàn)了c.610A→T的雜合突變,該家系健康成員和正常對(duì)照測(cè)序結(jié)果未見這種改變。此突變導(dǎo)致RUNX2編碼的轉(zhuǎn)錄因子第204位氨基酸的密碼子AAA被UAA取代,從而使其編碼的賴氨酸變成終止密碼(K204X),致使其后的多肽鏈翻譯終止。也就是說(shuō)c.346T→A和c.610A→T的雜合突變是引起兩個(gè)家系患者發(fā)病的分子基礎(chǔ)。

3 討論

傳統(tǒng)的疾病診斷方法都是以疾病表型改變?yōu)橐罁?jù),但表型改變很多并不是特異的,出現(xiàn)時(shí)間也較晚,往往不能及時(shí)、及早地明確診斷,失去早期預(yù)防和治療的機(jī)會(huì)。基因診斷不僅可以幫助確診現(xiàn)患者,估計(jì)預(yù)后,更重要的是能診斷癥狀前患者,給他們的生活方式提出合理建議,檢出女性攜帶者,為她們提供遺傳咨詢,預(yù)測(cè)再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和提供產(chǎn)前診斷。

CCD的致病基因(CBFA1)編碼成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子,是哺乳動(dòng)物編碼轉(zhuǎn)錄因子PEBP2/CBF異二聚體α亞單位的三個(gè)基因之一[3]。研究發(fā)現(xiàn)RUNX2基因敲除小鼠模型沒(méi)有骨組織和成骨細(xì)胞,這表明該轉(zhuǎn)錄因子為成骨細(xì)胞分化所必需,在維持正常的骨骼生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要的作用。迄今報(bào)道引起CDD患者受累的RUNX2基因突變包括缺失、插入、錯(cuò)義突變、無(wú)義突變及剪接體突變等多種類型,但以發(fā)生在“Runt域”的錯(cuò)義突變最常見[4]。在已報(bào)道的導(dǎo)致中國(guó)人散發(fā)和家族性CCD發(fā)病的基因突變幾乎都是“Runt域”的點(diǎn)突變所致錯(cuò)義突變[5]。本研究鑒定出的引起兩個(gè)中國(guó)人家族性CCD的致病突變也均為“Runt域”的點(diǎn)突變,說(shuō)明“Runt域”的點(diǎn)突變是中國(guó)人RUNX2突變的主要類型,但其中一個(gè)為無(wú)義突變。

典型CCD一般臨床即可診斷,但對(duì)于輕癥特別是僅有牙齒萌出異常的患者臨床診斷困難,檢測(cè)RUNX2基因可以進(jìn)行基因診斷;由于本病目前尚無(wú)確切有效的治療手段且外顯率高,對(duì)于已發(fā)現(xiàn)的CCD患者應(yīng)進(jìn)行遺傳咨詢,通過(guò)產(chǎn)前診斷發(fā)現(xiàn)攜帶致病基因的胎兒,可以及時(shí)終止妊娠。雖然以往報(bào)道的RUNX2突變中有幾個(gè)熱點(diǎn)突變,但隨著對(duì)更多CCD家系的基因檢測(cè),發(fā)現(xiàn)了越來(lái)越多的新突變類型,例如本研究?jī)蓚€(gè)中國(guó)人群無(wú)關(guān)家系的致病突變均為新突變,因此,對(duì)RUNX2基因的所有7個(gè)外顯子及其側(cè)翼進(jìn)行測(cè)序是比較準(zhǔn)確有效的基因診斷方法。

[1] 高超,吳麗,耿香菊,等.先天性顱鎖骨發(fā)育不全家系分析[J].中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志,2010,13(23):54-55.

[2] 高超,吳麗,耿香菊,等.兩個(gè)新RUNX2基因突變引起家族性鎖骨顱骨發(fā)育不全[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志,2010,27(2): 140-143.

[3] Ogawa E,Maruyama M,Kag oshima H,et al.PEBP2/PEA2 represents a family of transcription factors homologous to the products of the Drosophila runt gene and the human AM L1 gene[J].Proc Natl Acad Sci USA,1993,90:6 859-6 863.

[4] Kim HJ,Nam SH,Kim HJ,et al.Four novel RUNX2 mutations including a splice donor site result in the cleidocranial dysplasia phenotype[J].J Cell Phy siol,2006,207,114-122.

[5] Xuan D,Li S,Zhang X,et al.Mutations in the RUNX2 gene in Chinese patients with cleidocranial dysplasia[J].Ann Clin Lab Sci,2008,38:15-24.