基于DNA熔解溫度設計新型基因探針的探索

陳澤琴，豆興茹，謝洪平

（1.蘇州大學 醫學部藥學院，江蘇 蘇州 215123；2.西華師范大學 化學化工學院，四川 南充637002）

1 實驗

1.1 儀器與試劑

LS-55熒光分光光度計（美國Perkin Elmer公司）；智能型超級恒溫水槽（寧波天恒儀器廠）；移液槍（Eppendorf，德國）；EP管；容量瓶.

寡核苷酸探針（P1，P2，P3，P4，P）、靶DNA序列（T）和錯配DNA序列（MT）（上海生工生物工程技術服務有限公司，均為PAGE級，見表1），溴化乙錠（Sangon），Tris、鹽酸、EDTA，實驗所用試劑均為分析純.所有溶液均為去離子水配制.

1.2 溶液配置

TE緩沖溶液（10mmol/L，pH8.0 Tris-HCl，1mmol/L EDTA）的配制：分別稱取0.120g Tris和0.037g EDTA·Na2·2H2O，加適量蒸餾水溶解，用1mol/L鹽酸調至pH8.0，并定容至100mL.

探針和靶DNA儲備液的配制：分別向T、MT和P1樣品管（1OD）中加入51μL的TE緩沖溶液，即得T、MT和P1的10-4M儲備液.分別向P2、P3、P4和P樣品管（1OD）中加入80μL、78 μL、158μL和55μL的TE緩沖溶液，即得10-4M的P2、P3、P4和P的儲備液.

溴化乙錠（EB）溶液的配制：精密稱取0.004g EB樣品，溶于少量水中，用10mL的棕色容量瓶定容，即得10-3M的溶液，室溫保存.

1.3 檢測靶DNA

本研究中樣本的熒光檢測條件為：激發波長528nm，發射波長范圍540～700nm,激發狹縫寬度10nm，發射狹縫寬度5.0nm.

1.3.1 基于探針P1和P2檢測靶DNA（T）及錯配DNA（MT）

EB熒光測定：取2份594μL TE緩沖液分別在25℃、50℃水浴中保溫2h，再分別加入6μL 10-3M的EB溶液，混勻，5min后測熒光.

加強對河道的清淤疏浚施工工作，讓河道充分發揮其重要功能。重要作用。因此要加強對清淤疏浚技術的研究，對有關問題進行有效控制，保證各項生產活動順利完成。在具體的工作中，應做好準備工作，掌握現場的實際情況，落實施工準備工作。還應做好安全生產工作，建立健全安全生產責任制，采取有效的安全防范措施，嚴格執行各項安全管理制度。有關部門負責人按照相關規定，組織人員進行河道清淤疏浚工作，保證河道順通無阻，發揮河道在生產生活活動中的積極作用，促進經濟建設事業不斷發展壯大，提高人們的生活水平。

探針熒光測定：在590.2μL TE緩沖液中分別加入1.92μL 10-4M的P1和P2儲備液，在25℃下孵化2h，加入6μL 10-3M的EB溶液，混勻，5min后測熒光.在50℃下孵化的另一份樣品同上法操作.

DNA雜交體系的熒光測定：在588.2μL TE緩沖液中分別加入1.92μL 10-4M的P1、P2和T的儲備液，在25℃下孵化2h，再加入6μL 10-3M的EB溶液，混勻，5min后測其熒光.在50℃下孵化的另一份樣品同上法操作.對于錯配的雜交體系（即靶MT的檢測體系），操作同上述匹配的靶T.

1.3.2 基于探針P3和P4檢測靶DNA EB熒光測定：將594μL TE緩沖液在25℃水浴中保溫2h，加入6μL10-3M的EB溶液，混勻，5min后測熒光. P3和P4探針熒光測定：在590.2μL TE緩沖液中分別加入1.92μL 10-4M的P3和P4儲備液，在25℃下孵化2h，加入6μL 10-3M的EB溶液，混勻，5min后測熒光.

DNA雜交體系的熒光測定：在588.2μL TE緩沖液中分別加入1.92μL 10-4M的P3、P4和T的儲備液，在25℃下孵化2h，再加入6μL 10-3M的EB溶液，混勻，5min后測其熒光.對于錯配的雜交體系（即靶MT的檢測體系），操作同上述匹配的靶T.

1.3.3 基于探針P檢測靶DNA

EB熒光測定：594μL TE緩沖液在25℃水浴中保溫2h，加入6μL 10-3M的EB溶液，混勻，5min后測熒光.探針P的熒光測定：在592.1μL TE緩沖液中加入1.92μL 10-4M的P儲備液，在25℃下孵化2h，加入6μL 10-3M的EB溶液，混勻，5min后測熒光.

DNA雜交體系的熒光測定：在590.2μL TE緩沖液中分別加入1.92μL 10-4M的P和T的儲備液，在25℃下孵化2h，再加入6μL 10-3M的EB溶液，混勻，5min后測其熒光.對于錯配的雜交體系（即靶MT的檢測體系），操作同上述匹配的靶T.

表1 DNA探針以及相應目標鏈的堿基序列

2 結果與討論

2.1 熔解溫度對基于P1和P2探針構建的檢測體系的影響

在該檢測體系中，P1和P2彼此間存在著互補的部分，同時分別與靶DNA（完全互補的即為T，一個堿基錯配即為MT）也存在互補的堿基部分（見圖1）.當三條鏈同時存在時，可以形成三聯莖的結構，EB可以嵌插到三聯莖的雙螺旋中，產生強的熒光，從而檢測到靶DNA.

在體系中與靶DNA序列配對的兩個DNA探針是依據熔解溫度設計的.探針P1與靶序列的熔解溫度要高于反應溫度，而探針P1與P2互補鏈的熔解溫度要低于反應溫度.這樣的設計使探針P1與靶序列在反應溫度下能夠雜交，排除了探針P1與P2在此條件下的雜交，保證了在沒有靶序列存在下低的背景.

對于T的檢測體系中，存在三個互補鏈，即P1與P2、P1與T、P2與T，若將此三個互補鏈分別作為一個獨立的DNA體系，通過Zuker法[1]計算其熔解溫度，P1與P2為11℃，T與P1為54℃.它們之間應存在著相互作用[7]，可能導致整個檢測體系（即三聯莖雙螺旋結構）的熔解溫度高于54℃，但是，這種預測不能通過Zuker法計算證實.若設計實驗溫度低于54℃，P1與T必然互補雜交，由于三聯莖結構的相互作用，雖然反應溫度高于P1與P2以及P2與T互補鏈的熔解溫度，但它們仍然能夠形成圖1所示的三聯莖結構的雜交體系.相對于僅僅只有一個與被檢T完全互補的探針，這種結構中存在著更長的雙螺旋結構，使嵌插的EB熒光更強.對于不存在被檢T時，由于P1與P2雜交體系的熔解溫度遠低于實驗溫度，它們必然解鏈，保證了體系的熒光與基底EB相同.基于上述理論，必然導致檢測靈敏度提高.據此，本文設計了該檢測體系.

當DNA序列有一個堿基錯配（MT）時，探針P2與MT互補的雙鏈解開，此時由于P1探針與P2探針互補鏈的熔解溫度低于反應溫度，探針P1與P2互補的雙鏈也解開，而探針P1與MT互補雙鏈的熔解溫度（54℃）高于反應溫度（50℃），所以最后只剩下探針P1與MT的互補雙鏈，嵌插入雙鏈中的EB減少，因而此時的熒光強度要比靶DNA（T）雜交時的熒光強度低.然而從圖2中我們可以看出，錯配（MT）與靶DNA（T）之間的熒光強度差異并不明顯.

當反應溫度為25℃時，由于反應溫度低，探針P1與P2彼此間互補的部分形成了一定的雙螺旋結構，因而此時的基底熒光相對較高，如圖3所示，同時錯配（MT）與靶DNA（T）之間的熒光強度差異也并不明顯.

圖1 探針P1、P2檢測靶DNA的原理示意圖

圖2 50℃時P1，P2檢測靶DNA與錯配DNA鏈

圖3 25℃時P1，P2檢測靶DNA與錯配DNA鏈

2.2 不同探針體系對靶DNA檢測的影響

探針P3、P4分別與靶DNA互補，但彼此間不存在互補的部分，由圖4可以看出，反應溫度為25℃時，探針P3、P4將T與MT分開的能力比探針P1、P2強，而且因為探針P1、P2彼此間存在互補的部分，在此溫度下，基底熒光強于探針P3、P4.探針P4與靶DNA互補雙鏈的熔解溫度較低，存在一個堿基錯配時，探針P4與靶互補雙鏈解開的程度大于探針P2與靶互補雙鏈，所以使得探針P3、P4的鑒別能力強于探針P1、P2.

探針P為與靶DNA相同長度的互補探針，相當于探針P3和P4連接而成.如圖5所示，探針P在25℃檢測靶DNA（T）與錯配(MT)時，基底熒光強于探針P3、P4，同樣不存在雙鏈，且總長度和堿基數都相同，但探針P的基底熒光強于探針P3、P4，這表明整體鏈的作用力強于單個鏈的作用力.同理，探針P與靶DNA（T）作用能力強于探針P3、P4，所以探針P檢測體系的靶DNA的熒光強度高于探針P3、P4檢測體系.而探針P與錯配（MT）的作用力也強，因而鑒別靶DNA（T）與錯配（MT）的能力弱.

從以上的實驗結果可以看出，根據熔解溫度設計的新型基因探針P1、P2可以在高的反應溫度下降低基底熒光，同時保證相對較高的靶熒光強度，但是鑒別單個堿基錯配的能力較弱.按照本文設計的實驗原理，探針P1、P2檢測體系可以降低背景，增強靈敏度，有利于鑒別錯配，但由實驗結果可以看出，此基因探針并不能很好地鑒別出錯配的靶.從探針P3、P4檢測體系以及探針P檢測體系的實驗結果中也可以看出，DNA鏈的整體作用力要比單個短鏈間的作用力強，因而可以設想三條互相互補的DNA鏈間的整體作用力遠比它們之間單獨的作用力強，所以鑒別單個堿基錯配的能力并不強.應用Zuker法可以計算出簡單的兩條雙螺旋鏈的熔解溫度，而在復雜體系中形成的結構復雜的雙螺旋鏈就不能用此方法計算出熔解溫度.本文中探針P1、P2檢測體系最終形成的是類似“Y”形的三聯雙螺旋結構，這樣的結構就不能夠用Zuker法準確地計算出整體雙螺旋的熔解溫度，因而按照本實驗原理，確定適當的反應溫度來進行靶DNA的檢測時就不能很好地區分出靶與單個堿基錯配的DNA鏈.所以在設計復雜的檢測體系進行靶DNA檢測時，并不能直接依賴于此熔解溫度計算方法，而是要考慮到整個鏈間的作用.

圖4 25℃時P3，P4檢測靶DNA錯配DNA鏈

圖5 25℃時P檢測靶DNA錯配DNA鏈

3 結論

本文利用DNA熔解溫度進行新型基因探針設計的探索，用到了Zuker熔解溫度計算程序.將Zuker程序計算出的熔解溫度運用于本文新型的基因探針中，按照設計的原理可以降低背景，增強靈敏度，利于鑒別錯配，但這種熔解溫度計算程序只能算出兩條鏈雙螺旋的熔解溫度而不能計算出整個三聯莖雙螺旋的熔解溫度，因而鑒別靶與錯配的能力較低.在設計新型的基因探針時，不能單純地依靠Zuker熔解溫度計算方法，要考慮到整個體系的作用.

[1]Nicholas RMarkham,Michael Zuker.DINAMeltweb server for nucleic acid melting prediction[J].Nucleic Acids Research,2005, 33:577-581.

[2]Angel AMart?,Cindy A Puckett,Joanne Dyer,etal.Inorganic-Organic Hybrid Luminescent Binary Probe for DNA Detection Based on Spin-Forbidden Resonance Energy Transfer[J].JAm Chem Soc,2007,129:8680-8681.

[3]HaoWang,Jishan Li,YongxiangWang,etal.Combination of DNA Ligase Reaction and Gold Nanoparticle-Quenched Fluorescent Oligonucleotides:A Simple and Ef fi cient Approach for Fluorescent Assaying of Single-Nucleotide Polymorphisms[J].Anal Chem, 2010,82:7684-7690.

[4]Ningning Zhu,Yuqing Lin,Ping Yu,etal.Label-free and sequence-speci fi c DNA detection down to a picomolar levelwith carbon nanotubesas support for probe DNA[J].Analytica Chimica Acta,2009,650:44-48.

[5]Yi Xiao,Xinhui Lou,Takanori Uzawa,et al.An Electrochemical Sensor for Single Nucleotide Polymorphism Detection in Serum Based on a Triple-Stem DNA Probe[J].JAm Chem Soc,2009,131:15311-15316.

[6]Kun Yang,Chun-yang Zhang.Improved Sensitivity for the Electrochemical Biosensorwith an Adjunct Probe[J].Anal Chem,2010, 82:9500-9505.

[7]Yanli Zhang,YingWang,HaiboWang,etal.Electrochemical DNA Biosensor Based on the Proximity-Dependent Surface Hybridization Assay[J].AnalChem,2009,81:1982-1987.