湖北茯苓菌種生產技術規程△

李苓，王克勤，邊銀丙，蘇瑋，王蘭英

（1.北京同仁堂湖北中藥材有限公司，湖北 武漢 430071；2.湖北省中醫藥研究院，湖北 武漢 430074；3.華中農業大學，湖北 武漢 430074）

湖北茯苓菌種生產技術規程△

李苓1，王克勤2*，邊銀丙3，蘇瑋2，王蘭英1

（1.北京同仁堂湖北中藥材有限公司，湖北 武漢 430071；2.湖北省中醫藥研究院，湖北 武漢 430074；3.華中農業大學，湖北 武漢 430074）

按照我國 《中藥材生產質量管理規范（GAP）》的綜合技術要求，通過對湖北茯苓菌種培育場地環境，菌種制備，質量標準與檢驗規程等規范化研究，制訂了湖北茯苓菌種生產技術規程，以指導湖北茯苓產區茯苓菌種的規范化生產。

茯苓；菌種；規范化

茯苓是我國傳統常用中藥材及藥食兼用資源，其物種為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf[1]。野生茯苓在我國分布較廣，但零星分散，難以采挖，茯苓藥材多由人工栽培提供。我國是世界上唯一進行茯苓栽培的國家[2]，有著悠久的栽培歷史，長期由產區農民使用松樹段木或樹蔸作培養料，選用新鮮菌核作種源，20世紀70年代以來，改進為人工分離、培育的 “純菌絲菌種”作種源，進行擴大培育[3]。 “九五”期間，我們針對茯苓栽培中普遍存在的菌種來源混雜，生產操作隨意，質量不穩等弊端，進行了 “茯苓藥材規范化種植研究”[4]，期間按照我國 《中藥材生產質量管理規范（GAP）》的綜合技術要求，制訂了 “茯苓菌種生產技術規程”，現報道如下。

1 內容與適用范圍

本規程規定了茯苓菌種規范化生產技術的術語和定義，母種分離、培養，原種擴制，栽培種生產，菌種質量標準，菌種質量檢驗規程，菌種的包裝、標識、儲存及運輸。

本規程適用于湖北及我國茯苓產區茯苓菌種的規范化生產。

2 引用標準

GB3095-1996大氣環境質量二級標準

GB5749-2006生活飲用水衛生標準

NY/T528-2002食用菌菌種生產技術規程

《中藥材生產質量管理規范（試行）》國家藥品監督管理局局令第32號

《湖北省食用菌菌種管理辦法》湖北省人民政府令第330號

3 定義

3.1 菌種（pure culture）

經人工培養并可供進一步繁殖或栽培使用的茯苓菌絲體及其生長基質組成的繁殖材料，包括母種、原種、栽培種。

3.2 種苓（mother sclerotium）

經精心培育、選擇，用于分離茯苓母種的優質鮮茯苓菌核。

3.3 菌齡（cell ages）

菌種菌絲體的生長時間，即菌種自接種至使用之間的間隔時間。

4 母種分離、培養

4.1 母種培育廠的環境及設施要求

一般設置在大專院校或科研單位，應具有接種室、儀器室、配料室、實驗室。必須配備恒溫培養箱、干燥箱、冰箱、顯微鏡、天平及接種設備，試管、培養皿、三角瓶等玻璃儀器，消毒藥品，化學試劑等。

從事母種分離、培育的人員必須具備藥學、生物或相關學科大學學歷、副高級藥學技術職稱及執業藥師資格，并具有獨立工作能力和豐富的操作經驗。

4.2 種苓的選擇

在傳統產區，經提前精心培育而成的優質鮮茯苓菌核；個體較大，近球形，外皮較薄，色黃棕或淡棕，有明顯的白色或淡棕色裂紋，重量＞2.5 kg；生長旺盛，切開或掰開后，內部苓肉色白，茯苓氣味濃郁，有乳白色汁液或淡青色漿汁滲出；外皮完整，無蟲咬損傷，無腐爛異味。

種苓選定后要及時進行分離使用，若需暫短儲存或運往他地使用，必須埋于濕沙中儲存，以防干燥。

4.3 母種培養基的制備

4.3.1 配方 馬鈴薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1 000 mL。

4.3.2 配制 將馬鈴薯去皮，洗凈，切片，加水1 000 mL，煮沸30 min，過濾，濾液中加入瓊脂，煮至全部溶化，再加入葡萄糖，攪拌溶化，補足水分至1 000 mL，分裝于試管中，塞上棉塞。

4.3.3 滅菌 將配制的母種培養基置高壓滅菌鍋內，用1.05 kg·cm－2壓力（溫121℃）滅菌30 min，趁熱擺放斜面，冷卻后備用。

4.4 組織分離

4.4.1 分離前準備 按無菌操作法對無菌室或無菌箱內的空氣、環境、操作臺面、用具及移入的培養基試管等進行表面消毒滅菌，操作人員按無菌操作著裝、手部消毒。

4.4.2 種苓表面消毒 將選好的種苓用清水沖至無泥沙，待表面稍干后，移入無菌室凈化工作臺上。用0.2%升汞或70%乙醇沖洗，進行表面消毒，再用無菌水沖洗數遍，除去表面藥液。打開紫外線燈照射5～10 min。

4.4.3 種苓切剖 待種苓表面稍干，用滅菌刀從種苓的中央切一淺口，掰開。

4.5 接種

用滅菌的解剖刀或接菌鏟在近茯苓皮內側2～3 cm處，挑取0.1 cm厚、0.5 cm見方的白色苓肉，接于試管斜面培養基上。

用同樣方法依次挑取苓肉進行分離、接種一批試管。將分離、接種后的試管，貼上標簽，其內容應符合 《湖北省食用菌菌種管理辦法》規定，如編號、種苓來源、接種時間等。

4.6 培養與剔雜

將試管置于22～25℃的恒溫培養箱中培養5～7 d。培養2 d，可見接種塊周圍長出白色絨毛狀的茯苓菌絲。隨著培養時間的延長，可見茯苓菌絲在培養基上不斷延伸，5～7 d，茯苓菌絲即可長滿培養基表面。培養過程中經常觀察菌絲生長情況，凡菌絲長速慢、稀疏、不勻、發黑、污染者，須及時剔出。母種轉管次數應控制在2～3次。

5 原種擴制

5.1 原種廠的環境及設施要求

可選建在產區，但必須遠離交通干道，通水、通電、通路，無粉塵污染，大氣、水質等環境質量，必須符合國家相關標準，廠房周圍應有綠化樹木或草皮，生產區周圍無豬圈、牛欄、廁所等污染源。廠內環境必須整潔、干凈，并定期打掃、清理，保持墻壁及地面清潔衛生，做到無塵垢、無污穢。

原種廠須經縣級農業部門審查批準，領取菌種生產許可證。廠內分設洗滌室、配料室、滅菌室（區）、接種室（具緩沖間）、培養室、貯存室等，必須配備接種箱、高壓滅菌鍋或常壓滅菌灶（自制）、恒溫箱、培養室木架、天平、磅秤及接種設備，玻璃儀器，消毒藥品，化學試劑等。

從事原種擴制、培育的人員必須具備高中以上（含高中）學歷、農業技術員職稱，掌握微生物基礎知識，具有獨立工作能力及熟練的操作技能。講究個人衛生，操作中必須使用專用的工作服、帽。嚴格操作，認真填寫原始記錄。

5.2 原種培養基的制備

5.2.1 配方 小麥粒90%、松木屑10%、營養液[1%蔗糖、0.5%NH4NO3或（NH4）2SO4]。

5.2.2 配制 除去麥粒癟粒、雜質，洗凈，置40℃左右的營養液中浸泡10 h，取出，瀝干，與5%的松木屑混勻，裝于500 mL廣口瓶或折角呈方形底的聚丙烯塑料袋（Φ12 cm，高25 cm，厚4絲）中，邊裝邊振搖，并用扁形鐵鉤或細木棒稍壓實，使之均勻裝至瓶（或袋）肩處。將另5%松木屑用營養液潤濕，覆蓋于培養基表面，厚約0.5 cm。揩凈瓶（或袋）內、外壁沾附物，塞緊棉塞，扎口。

5.2.3 滅菌 將配制的原種培養基置高壓蒸氣滅菌鍋內，用0.137 3 MPa壓力（溫度126℃）滅菌2 h，或用流通蒸氣（100℃）滅菌8～10 h，冷卻后備用。

5.3 接種

在無菌室內，用無菌操作法，挑取長寬各1.5 cm左右的優質母種塊（連同培養基），移植接種于母種培養基上端中央，隨即蓋塞或扎口。

在接種后的原種瓶（袋）上貼上標簽，其內容應符合 《湖北省食用菌菌種管理辦法》規定，如編號、母苓來源、接種時間等。

5.4 培養與剔雜

將接種后的原種瓶（袋）置于25～30℃培養室中培養。當茯苓菌絲生長至瓶（袋）內2/3處時，移入10～25℃的常溫培養室內繼續培養。接種后的母種塊，在原種培養基內培養1～2 d，可見茯苓菌絲恢復生長，并逐漸由母種塊向外延伸。培養過程中須經常檢查菌絲生長情況，凡表現異常，特別是長速慢、菌絲稀疏、不勻、發黑、污染者須及時剔出，深埋。

5.5 清場

每一批次的原種生產完成后，均應進行清場，包括清除生產中的廢棄物，作好環境清潔，將物品定位放置，并做好清場記錄。

6 栽培種生產

6.1 栽培菌種廠的環境及設施要求

茯苓栽培菌種廠可選建在產區，廠周及廠內環境要求等與原種廠相同。

栽培菌種廠須在鄉鎮（或縣）備案。廠內分設洗滌室、配料室、滅菌室（區）、接種室（或接種箱）、冷卻室、培養室、成品貯存室、原料貯藏室、工作室等。菌種廠要求安裝防蟲、防鼠設備，并配備常壓滅菌灶（自制）、培養室木架、天平、磅秤及接種設備，必要玻璃儀器，消毒藥品，化學試劑等。

從事栽培菌種生產、培育的人員必須具備初中以上（含初中）學歷，經專業技術培訓合格，熟悉微生物基礎知識，具有獨立工作能力及操作技能。講究個人衛生，操作中必須使用專用的工作服、帽。嚴格操作，認真填寫原始記錄。

6.2 栽培種培養基的制備

6.2.1 配方 松木屑78%、米糠（或麥麩）20%、蔗糖1%、熟石膏1%、水料比1∶1.0～1.2。松木屑要求新鮮、干燥，無霉變，使用前應經日曬或室內堆放干燥處理。

6.2.2 配制 首先將蔗糖溶于水，將米糠（或麥麩）與熟石膏混勻，再加入松木屑，拌勻，然后加入蔗糖水翻拌均勻，使培養基含水量65%～70%（即緊握培養基料使指尖稍見滲水為度）。放置30 min，待水分均勻滲入料中進行裝袋；將折角呈方形底的聚丙烯塑料菌種袋（Φ12 cm，高25 cm，厚4絲）撐開，裝料，每袋400 g左右，壓實，擦凈袋口內外壁沾附物，扎口。

6.2.3 滅菌 將上述料袋置高壓滅菌鍋內，用0.137 3 MPa壓力（溫度126℃）滅菌2 h，或置常壓滅菌灶內，用流通蒸氣（100℃）滅菌8～10 h，冷卻后備用。

6.3 接種

在無菌室內，用無菌操作法，將原種瓶（袋）打開，除去原種表面的菌膜及表面培養物。用接種槍或接種匙取5 g左右略加搗碎的原種塊，移于栽培種培養基上，封口。

在接種后的菌袋上貼上（印有）標簽，其內容符合 《湖北省食用菌菌種管理辦法》規定，如編號、原苓來源、接種時間等。

6.4 培養與剔雜

高溫培養：將接種后的菌種袋連同周轉箱一起置于高溫培養室內，在25～30℃溫度下培養。

常溫培養：待菌絲生長延伸至培養料2～3 cm處，移入10～25℃的常溫培養室內繼續培養，20～30 d，茯苓菌絲可長滿菌袋。

培養過程中，經常檢查培養室溫、濕度變化及菌絲生長情況，發現菌絲長速明顯緩慢，菌絲稀疏、不均、地圖斑、發黑、雜菌污染，及時剔出，深埋。菌絲滿料后，逐一檢查菌種質量，合格品裝入專用包裝袋內，按批號歸類就地儲存。

6.5 清場

每一批次栽培種生產完成后，均應進行清場，包括清除生產中的廢棄物，作好環境的清潔，將物品歸位，并做好清場記錄。

7 菌種質量標準

7.1 母種質量標準

菌齡＜30 d；菌絲色白、均勻、致密、粗壯，茯苓特異香氣濃郁；菌絲體表面可見晶瑩的露滴狀分泌物；菌種試管完整無損，棉塞嚴密，無雜菌污染。

7.2 原種質量標準

菌齡20～45 d；菌絲生長旺盛，潔白、均勻、致密，爬壁現象明顯，有根狀菌索者佳；菌絲體尖端可見乳白色露滴狀分泌物，茯苓特異香氣濃郁；菌種瓶（或袋）完整無損，無雜菌污染。

7.3 栽培種質量標準

菌齡30～60 d；菌絲潔白致密，生長均勻，布滿菌袋內；菌絲體尖端可見晶瑩露滴狀分泌物，茯苓特異香氣濃郁；菌袋完整無破損，菌絲充滿菌種袋（滿料），手握菌種袋，感覺堅實，無松散，無軟化。菌絲無發黃、發黑，地圖斑，軟化，無子實體出現，無雜菌污染。

8 菌種質量檢驗規程

8.1 母種質量檢驗規程

按照茯苓母種質量標準，在自然光下采取目測方法，每隔2 d于培養過程中觀察各試管菌種萌發情況、生長速度、菌絲形態；凡表現異常，特別是長速慢、菌絲稀疏、不勻、發黑、污染者，應及時淘汰剔出；菌絲滿管后，按上述質量標準逐支檢查，合格者置冰箱4℃保存。

8.2 原種質量檢驗規程

按照茯苓原種質量標準，在自然光下采取目測方法，于培養過程中經常觀察各菌種瓶內菌種萌發、生長情況；凡發現菌絲長速明顯緩慢，菌絲稀疏、不均、地圖斑、發黑、污染者，應及時剔出；菌絲滿瓶后，按上述質量標準逐瓶檢查，合格者方可轉于下一道工序，作為茯苓栽培種生產的種源。

8.3 栽培種質量檢驗規程

按照茯苓栽培種質量標準，在自然光下采取目測法，于菌種培養過程中經常觀察各菌種袋內菌種生長情況；發現菌絲體發黃、發黑、不均、地圖斑、污染者，應及時剔出；逐一檢查各菌種袋，應符合上述質量標準，且菌絲長滿菌種袋（滿料），菌絲無倒伏現象；手握菌種袋，感覺堅實，無松散，無軟化；檢驗合格者按一定數量裝入專用包裝袋中，并做好菌種質量檢驗記錄。

9 包裝、標識、儲存及運輸

9.1 母種的包裝、標識、儲存及運輸

母種的包裝為試管，試管外應貼有標注編號、接種時間、生產批號、生產單位等內容的標簽。母種檢驗合格后，應置于4℃冰箱保存條件下進行儲存，儲存保質期的菌齡＜30 d。

運輸母種的外包裝為清潔、干燥的紙箱或專用鐵箱，裝箱時應使用清潔、干燥的碎紙條填充試管間的空隙，使其固定。包裝外應貼有標注茯苓母種、生產批號、生產單位等內容的專用標簽。

茯苓母種的運輸工具應清潔、干燥，不能與有毒、有害、有異味的物品混裝，運輸過程中應注意防震、防潮。

9.2 原種的包裝、標識、儲存及運輸

原種的包裝為廣口菌種瓶或聚丙烯塑料菌種袋，瓶或袋外應貼有標注編號、母苓來源、接種時間、生產批號、生產單位等內容的標簽。

原種檢驗合格后，應及時使用，或置于10～25℃的常溫培養室內儲存。儲存期間應按時進行抽樣檢查，及時剔出不合格品，并認真作好菌種儲存及抽樣檢查記錄。原種儲存保質期的菌齡＜45 d。

運輸原種的外包裝為清潔、干燥的專用紙箱或編織袋，箱（或袋）內應排放整齊，不留空隙，使其固定。包裝外應貼有標注茯苓原種、生產批號、生產單位等內容的專用標簽。

茯苓原種的運輸工具應清潔、干燥，不能與有毒、有害、有異味的物品混裝，運輸過程中應注意防震、防潮。

9.3 栽培種的包裝、標識、儲存及運輸

栽培菌種的包裝為聚丙烯塑料菌種袋，袋外應貼有標注編號、原苓來源、接種時間、生產批號、生產單位等內容的標簽。

栽培菌種檢驗合格后，應及時使用，或置于10～25℃的常溫培養室內儲存。儲存時，應將菌種按一定數量裝入專用包裝袋中，單層置于貨架或墊板上，碼放整齊，不得疊放，以免使菌種局部溫度過高，導致衰亡。儲存期間應按時進行抽樣檢查，及時剔出不合格品，并認真作好菌種儲存及抽樣檢查記錄。栽培菌種儲存保質期的菌齡＜60 d。

運輸原種的外包裝為清潔、干燥的專用紙箱或編織袋，箱（或袋）內應排放整齊，不留空隙，使其固定。包裝外應貼有標注茯苓栽培菌種、生產批號、生產單位等內容的專用標簽。

茯苓栽培菌種的運輸工具應清潔、干燥，不能與有毒、有害、有異味的物品混裝，運輸過程中應注意防震、防潮。

[1]國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫藥科技出版社，2010：224-225.

[2]婁隆后，朱慧真，周璧華.食用菌生物學及栽培技術[M].北京：中國林業出版社，1984：9.

[3]中國藥材公司.中國常用中藥材[M].北京：科學出版社，1995：1076-1085.

[4]付杰，王克勤，方紅，等.茯苓藥源及生產栽培現狀[J].中藥研究與信息，2002，4（2）：24-25.

“十二五”國家科技支撐計劃項目——茯苓規范化種植基地優化升級及系列產品綜合開發研究（2011BAI06B03）

*王克勤，E-mail：hbwhwkq＠163.com

2011-10-08）