MicroRNA在阿爾茨海默病發病機制中的作用

梁春聯，秦 川

（中國醫學科學院，北京協和醫學院，醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021）

阿爾茨海默?。ˋ lzheimer＇s disease，AD）是一種以進行性認知功能障礙和記憶損害為特征的神經退行性疾病。主要病理特征為皮質神經元數量減少，神經纖維纏結（neurofibrillary tangle，NFT），老年斑沉積（senile plaque，SP）等。

miRNA是一類長約22個核苷酸的內源性小分子RNA，由基因組轉錄生成。迄今為止，已鑒定的miRNA多達上千種（miRBase version 13.0，http：// m iRNA.sanger.ac.uk），調控機體約90％以上的基因表達，據推測，人體組織細胞內的每一個生理過程幾乎均受miRNA的調控［1］。miRNA調控紊亂可能是人體多種疾病發生的潛在因素，其中，m iRNA在神經生物學及神經退行性疾病中的作用也日益為研究人員所關注，本文就m iRNA與神經退行性疾病AD發生的相關研究進展做一綜述。

1 miRNA的生物合成

miRNA編碼基因在基因組中有多種存在形式：單拷貝、多拷貝或基因簇等。在哺乳動物體內，80％的miRNA位于基因的內含子區，而這些基因大多由RNA聚合酶Ⅱ聚合生成，因此，RNA聚合酶Ⅱ相關的轉錄因子參與調控m iRNA的時空特異性表達模式。此外，還有一些miRNA位于基因間隔區，其轉錄活化由自身的啟動子介導。m iRNA基因由RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ轉錄生成原始轉錄本 miRNA（prim iRNA），在細胞核內pri-miRNA經屬于RNaseⅢ家族Drosha酶剪切生成長度約70nt核苷酸的發夾前體m iRNA（pre-miRNA），隨后pre-m iRNA被核轉運受體exportin-5由細胞核運送至胞漿，后在Dicer酶的作用下，被切割成19～23 bp的成熟的miRNA，成熟的m iRNA同RNA沉默誘導復合物（RISC）結合，通過不完全互補配對作用于mRNA的3＇UTR區，抑制mRNA的翻譯或促使其脫腺苷酸化而加速降解。經數據庫預測，一種m iRNA可調控上百種靶基因的表達，反之，一種 mRNA也可同時接受若干種miRNA的協同調控。此外，miRNA尚可調控轉錄因子及與其前體pre-miRNA剪切相關的蛋白質的表達，從而在m iRNA與其靶基因之間形成一個反饋調控機制，由此可見機體 miRNA調控網絡的復雜性［2］。

2 m iRNA在神經系統中的功能

人和嚙齒類動物的腦組織富含miRNA的表達，相對于其它器官而言，腦組織中表達的miRNA種類更多，水平也更高。Sempere等［3］通過 Northern雜交發現了小鼠及人腦中特有的 m iRNA：miR-9，-124a，-124b，-135，-153，-183，-219。小鼠及人腦中富含的7種miRNA：miR-9，-125a，-125b，-128，-132，-137，-139，然而，人和老鼠胎腦的m ir表達模式可能有所不同。

腦miRNA的表達受到精細的調控，在腦發育過程中，m iRNA的表達有一定的時序性。如：Mir-9，-125b，181a在胚胎發育初期低表達，隨著發育過程的演進表達增加，在出生后逐漸減少。此外，腦組織不同類型細胞有著不同的miRNA表達譜，如：有些m iRNA（m iR-124，m iR-128）在神經元細胞中優勢表達，有些miRNA（miR-23，miR-26，miR-29）僅在星形膠質細胞中或少突膠質細胞中高表達［4］。miRNA在胚胎腦組織發育中的作用已得到了充分證實，早期即通過Dicer酶缺失突變體證實了m iR-430家族在斑馬魚及小鼠腦組織形態發生中起著重要作用［5］。

隨著研究的進展，miRNA在神經系統中的的作用進一步得到了細化，而對某種特異性miRNA生理功能的深入研究也逐步顯示出miRNA與神經退行性疾病的潛在相關性，如：miR-134可影響樹突棘的形成［6］，m iR-124、m ir-132與軸突的生長有關［7，8］，而軸突生長不良及突觸結構的喪失均為AD發生的早期事件。此外，m iRNA還參與細胞周期及凋亡的調控［9，10］，而AD患者腦內神經元的丟失與細胞周期紊亂及凋亡水平的增加緊密相關。另Lukiw［11］等還發現AD患者腦內m ir-146a表達增加與其體內炎癥及應激反應有關。由此可見，miRNA可能通過多條途徑影響AD的發生與發展。

3 AD患者腦內m iRNA表達譜的改變

早期對miRNA在神經退行性疾病中的作用主要是通過缺失Dicer的細胞或動物模型進行的，如：敲除Dicer酶的小鼠海馬樹突棘可發生與AD相似的變化［12］。然而，敲除 Dicer是一種很粗略的實驗方法，因為其可導致細胞內所有miRNA成熟障礙，此外，敲除 Dicer的動物模型所呈現出的表型不僅僅是m iRNA缺失的后果，因為除m iRNA的剪切成熟之外，Dicer還有其它的功能，如：參與小干擾RNA的合成、維持異染色質結構等。但這些研究結果至少表明腦內m iRNA調控網絡的異常是神經退行性疾病發生的一個潛在因素。

鑒于腫瘤發生中m iRNA表達譜研究所取得的重大收獲，眾多科研人員也展開了對散發性AD患者腦內 miRNA表達譜的研究。Lukiw等［13］使用DNA芯片及Northern雜交的方法對胚胎、健康成年人及 AD患者腦內海馬區12種腦組織相關的miRNA的表達進行了分析，結果發現AD患者腦內miR-9，miR-125b，miR-128的表達升高，而miR-124a的表達降低。之后，Hebert［14］等對同齡對照及散發性AD患者大腦顳葉皮質區miRNA的表達進行了檢測，結果顯示AD患者腦內有13種miRNA的表達顯著降低，經數據庫比對后發現在這13種m iRNA中，有 7種具有與 AD相關的靶基因，即： m ir-15a，29b-1，9，19b與BACE1的3＇UTR有結合位點；mir-let-7，101，15a.106b與 APP3＇UTR有結合位點；m ir-9與PS 1的3＇UTR有結合位點。

對AD患者疾病早期腦及腦脊液中miRNA表達譜的分析顯示，除已知的作用機制外，miRNA還可通過一些新的途徑來影響AD的發生，如：氧化應激、胰島素抵抗、天然免疫等。研究發現［15］，AD患者海馬區 mir-423的表達上調，小腦 mir-98的表達下調，而這兩種 m iRNA均可調控異檸檬酸脫氫酶（IDH2）的表達，IDH2表達的降低與氧化應激的耐受性有關，這部分說明了腦不同部位對AD病理損傷的易感性（AD的病理損傷主要發生在海馬、皮質和皮質下區，而小腦相對較輕）。另外，該研究還發現在AD患者腦脊液中有6種m iRNA呈差異性表達，這提示miRNA有望成為疾病診斷的一種新的生化標記。目前，對患者腦脊液中 Aβ、總tau蛋白及磷酸化tau蛋白等分子的含量的檢測表明其具有高度的可重復性，然而，miRNA能否同上述指標一起作為AD早期診斷的分子標記物，尚有待進一步的研究。

最近，有研究人員通過芯片對AD患者大腦皮質m iRNA及mRNA的表達譜同時進行了檢測［16］。在差異表達的miRNA及mRNA中，有些miRNA與靶基因 mRNA負相關，這些 m iRNA多參與調控RNA的剪切及翻譯延長。而意外的是有些參與調控碳水化合物、脂肪酸代謝以及蛋白質重構的m iRNA的表達與其靶基因mRNA的表達呈正相關，這與傳統的m iRNA對靶基因的負調控作用相悖，然而，結合細胞周期阻滯時miRNA可活化靶基因表達的報道［17］，研究人員推測 m iRNA對靶基因的活化作用可能不僅是促進其翻譯，還可能與增強mRNA的穩定性有關。這些研究拓展了人們對m iRNA功能的認識，說明了在不同的細胞狀態和不同生理病理環境下miRNA可能具有不同的調節作用。2010年另有篇文獻報道［18］對早期 AD患者顳葉皮質區灰質和白質miRNA的表達譜分別進行了檢測，并對差異表達的m iRNA與AD病理特征-神經纖維纏結及老年斑的相關性進行了對比分析，表明灰質區一系列miRNA（如：mir-15，107及mir-29家族）的下調與老年斑的數量緊密相關，即：灰質miRNA的異常表達可能是導致AD病理改變的因素之一。

綜上，迄今為止盡管已有多篇文獻報道AD患者腦內miRNA表達譜的改變，然而，其結果之間缺乏一致性。這歸因于在腦m iRNA表達譜的分析中，技術方法的重要性，如：組織標本的來源、處理、病理損傷的程度、RNA的分離、芯片檢測技術及后續的數據分析等。需注意的事項有：①取材部位，腦組織由多種細胞類型構成，而不同細胞類型中miRNA的表達譜不同，因此，取材差異會導致標本的細胞成分發生變化從而影響試驗結果的可靠性；②標本來源，需注意女性患者和男性患者的疾病特征及 miRNA表達譜均有不同。③操作過程中miRNA的降解也是需要考慮的重要因素。

4 m iRNA調控AD致病基因的表達

至今，已有多篇文獻報道 BACE1的表達受miRNA的調控。Wang等報道［19］，與同齡對照相比，AD患者腦內mir-107的水平顯著降低，此外，他們檢測到在BACE1 mRNA的3＇UTR區存在有mir-107的結合位點，在疾病進展中，隨著 m ir-107的降低，BACE1蛋白水平呈增高趨勢。同年，Hebert［14］也報道發現mir-29a，mir-29b-1，mir-9能夠在體外調節BACE1的表達、β內分泌酶的活性及Aβ肽的產生。對臨床伴有BACE1蛋白水平異常增高的 AD患者腦內 mir-29a，mir-29b-1的檢測發現其表達顯著降低。值得注意的是上述兩項研究均表明： miRNA的降低并不與腦組織特定區域的疾病易感性相關，即：AD患者腦內運動皮層區m ir-107的表達、小腦mir-29a/b的表達也是減少的，這說明雖然這兩種m iRNA降低可誘發BACE1高表達，但其并非導致腦特定區域對疾病易感的因素。Boissonneault等［20］通過細胞試驗證實 mir-298、mir-328也可調控BACE1的表達，而AD模型小鼠海馬區miRNA的檢測結果顯示mir-298、mir-328的表達降低，表明其抑制作用的喪失是導致BACE1蛋白表達增加的因素之一。

除BACE1外，APP也是m iRNA靶向調控分子之一。據數據庫預測分析，APP mRNA3＇UTR區存在多個miRNA的潛在結合位點。研究表明［21］m iR-106a，miR-520c可負向調控APP的表達，細胞水平實驗表明，miR-106a，miR-520c過表達時可使 APP蛋白水平降低約 50％左右。另有研究報道［22］，miR-106b也可調節APP的表達，同時，該研究人員還發現AD患者顳葉皮質區m iR-106b的表達降低可能為AD發病的誘因之一。最近，有文獻報道［23］mir-101可調控APP的表達，原代培養的海馬神經元細胞試驗表明，m ir-101的表達與 APP蛋白水平負相關，并證實其可能為炎性細胞因子 IL-1B影響APP蛋白水平的機制之一。同時，對 AD模型鼠（SAMP8）的研究發現其 mir-16的表達顯著降低［24］，體內外試驗均表明mir-16高表達可顯著降低APP的蛋白水平，表明模型鼠體內 APP的聚集與m ir-16的表達降低相關。

值得注意的是，盡管目前對于m iRNA在AD發病機制中作用的探討已取得了一定的進展，但相關方面的研究還存在有一定的局限性：1）動物模型在疾病發病機制中的研究具有重要的價值，然而鑒于人體功能的特異性及復雜性，其結果并不能直接類推到人體內。2）每種m iRNA可靶向調控多種基因的表達，集中研究針對一種靶基因的作用雖有利于研究工作的進行，但這無疑忽視了m iRNA改變后的總體效應，即：上百種靶蛋白表達的改變，而這些改變的靶蛋白如何協同調控機體的功能尚有待進一步的研究。3）組織細胞內同時表達有多種miRNA，這些m iRNA協調一致共同發揮作用，聚焦單一m iRNA的作用就如同針對單一靶蛋白研究一樣，會混淆其生物效應的真實性。4）目前研究中多通過轉染使細胞高表達某種miRNA，繼而研究其功能，然而，人為的高表達miRNA會使其與細胞內源性表達的 m iRNA發生競爭（如：使內源性 m iRNA與RISC的結合幾率降低），導致內源性miRNA靶基因的表達增加。

此外，在研究m iRNA在AD發病機制中作用時，還有問題尚需探討：導致AD患者腦內miRNA異常表達原因是什么?其改變是疾病發生的誘因還是繼發事件?研究人員推測其合理的解釋有兩方面：1）隨著機體的老化及功能狀態的減退，m iRNA的合成及加工成熟發生障礙，miRNA表達水平改變成為疾病的誘發因素。2）其它始動因素導致疾病的發生，神經元毒性蛋白生成并影響miRNA的表達，繼而其靶蛋白表達發生改變（如：APP、BACE1），而反過來，靶蛋白含量的改變又可進一步影響m iRNA的表達，從而形成惡性循環促進疾病的演進及發展。

Lukiw等［25］通過實驗對這一推論給與了驗證：用硫酸鋁鐵處理原代培養的神經元細胞，誘導細胞ROS的產生。7天后對細胞中m iRNA進行分析，結果發現，在產生ROS的細胞中出現一系列表達上調的miRNA：miR-9、miR-125、miR-128，而如前所述這些m iRNA在AD腦中表達上調。這一發現說明氧化應激可通過改變miRNA的表達來影響神經系統的功能和退行性變的發生。最近，又有文獻報道［26］Aβ肽可影響細胞及體內m iRNA的表達。將原代培養的小鼠海馬神經元細胞經 Aβ肽處理后，檢測其miRNA的表達，結果發現47％的miRNA表達降低，18％的 miRNA表達增加，其中，下調最顯著的m iRNA的表達（m ir-409-3p、361、20b、181c、148b）可降低4倍左右，而對 APP23模型鼠海馬區miRNA的檢測也在體內證明了這一點。

結語及展望

隨著研究的進行，新的m iRNA不斷的被分離鑒定出來，對已鑒定的m iRNA在神經系統發育、正常功能及疾病狀態時表達模式的研究將具有重要的意義。而鑒于腦組織的多細胞類型成分及解剖和功能結構域的復雜性使得這一工作的開展具有一定的難度，但聯合使用原位雜交及其它技術（如免疫組化）來鑒定細胞類型及組織區域表達方式可望為其提供幫助。

鑒于miRNA在AD發病機制中作用的逐步揭示，通過寡核苷酸抑制或高表達miRNA有望成為疾病治療的新途徑，然而，其實際應用尚面臨著一定的挑戰：1）一種miRNA可在多大程度上調控哪些蛋白的表達有待探討；2）細胞內miRNA自身的表達調控及反饋調控機制尚不明了；3）如何克服血腦屏障在腦內抑制或高表達miRNA有待新的技術支持，此外，相關的生物利用度及毒性也是需要考慮的問題。

基于miRNA在神經系統發育、分化及突觸生成等方面的研究成果，miRNA在AD中的研究價值日益凸顯，篩選與疾病相關的m iRNA及其靶基因和相應的蛋白表達的改變仍將是該領域的研究焦點。隨著年齡的老化及細胞分裂的進行，機體m iRNA的合成、代謝及功能也有可能會發生一系列的變化，而對這一過程的深入了解將有助于其在AD等老年性疾病中作用的探討。此外，基因3＇UTR區的多態性也可能與AD患者腦內Aβ肽聚集等病理變化相關，因為 3＇UTR的多態性有可能會增加或減少miRNA的靶向作用位點，因此，進一步鑒定致病基因（如：APP等）3＇UTR區m iRNA結合位點的遺傳多態性將有望為AD發病機制提供新的詮釋。

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