小型模式生物在病毒作用機制研究中的應用

沈 琮，何琪楊

(中國醫學科學院北京協和醫學院醫藥生物技術研究所，北京 100050)

小型模式生物在病毒作用機制研究中的應用

沈 琮，何琪楊

(中國醫學科學院北京協和醫學院醫藥生物技術研究所，北京 100050)

小型模式生物如酵母、線蟲、果蠅、斑馬魚等在生命科學研究中應用廣泛，將其應用于病毒的研究，使人們對病毒-宿主的相互作用以及生物體的抗病毒免疫機制有了新的認識。本文對這些小型模式生物的特點及其在病毒機制研究中的應用做簡要介紹。

模式生物;病毒;酵母;線蟲;果蠅;斑馬魚

病毒感染性疾病是嚴重威脅人類健康的一類重要疾病。盡管對病毒感染機體的分子機制已有很多認識，但病毒與宿主的相互作用以及其細胞因素調節病毒基因表達的許多規律尚未得到徹底闡明，這是根治艾滋病、病毒性肝炎等難治性傳染病的瓶頸所在。細胞培養和建立動物感染模型是病毒學研究的經典方法，細胞培養體系和動物模型的缺乏會嚴重阻礙對病毒機制的研究以及抗病毒藥物的篩選［1］。某些具有嚴格種屬特異性的病毒(如巨細胞病毒CMV)，體外培養只能采用自然宿主來源的細胞系;某些病毒的自然宿主僅為人和靈長類，需要建立可行的動物研究模型;此外，人類龐大的基因組、表觀遺傳學的修飾以及病毒變異株和新病毒的不斷出現，在一定程度上增加了研究的難度。

模式生物是人們在長期研究生命科學的過程中建立起來的、可以模擬某個特定生理或病理過程的重要實驗材料。目前，多種模式生物的基因組測序已經完成，蛋白質組學數據庫和基因表達數據也陸續建立。除常用的大鼠、小鼠、兔子等大型的模式生物之外，應用小型模式生物如酵母、線蟲、果蠅和斑馬魚等的研究，近年來發展迅速，取得了大量的研究成果。小型模式生物具有結構簡單、操作方便、生長繁殖快、飼養成本低等特點，使其在病毒作用機制的研究中較其它大型模式生物更具優勢。它們的應用有力地促進了病原學的發展，使許多難以解決的人類難題變得明朗。

1 酵母

酵母是簡單的單細胞真核生物，約有6000個基因，1996年酵母全基因組測序完成后發現：60%以上為功能基因，其中40%含有與人類基因相似的保守序列。作為模式生物的酵母主要有釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)兩種，二者在細胞周期調控的研究中具有重要地位。在病毒研究中使用酵母也取得了大量成果。

酵母基因文庫可用于大規模篩選疾病關聯基因以及與病毒復制相關的宿主蛋白。用酵母篩選到熱休克蛋白Hsp70能夠抑制由HIV-1的輔助蛋白Vpr引起的細胞周期阻斷，這種抑制作用已在HIV-1感染的人體細胞中得到證實［2］。

基于酵母系統已闡明了多種病毒(如人免疫缺陷病毒HIV、丙型肝炎病毒 HCV、EB病毒)中的某些特異蛋白的功能。Vpr在HIV復制和核運送中起重要作用，把Vpr基因轉化到酵母中，也觀察到了與在HIV-1感染的人體細胞中相似的功能，具體表現為增加酵母細胞壁的幾丁質合成、干擾細胞骨架并改變細胞極性［3］。雖然 Vpr使細胞阻斷在 G2期，但不影響紫外線引起的損傷效應。進一步研究發現，Vpr影響細胞周期與 Wee1、PP2A的組分 Ppa2和 Rad24 的表達有關［4-6］。

酵母在RNA病毒復制周期及相關宿主因子的研究中發揮了重要作用。首個利用酵母體系擴增的高等真核生物病毒是雀麥花葉病毒(Brome mosaic virus BMV)，一種基因組為單正鏈RNA的植物病毒。之后，一些 DNA病毒如人乳頭瘤病毒HPV、牛乳頭瘤病毒BPV等也在酵母中得到復制和擴增［7］。為研究病毒宿主相互作用、尋找新的抗病毒藥物靶點創造了條件。

在蛋白表達及藥物篩選中的作用：酵母中表達的重組乙肝表面抗原已發展成為廣泛應用的乙肝疫苗;某些病毒復制所必需的宿主蛋白只存在于人體細胞，而酵母細胞中沒有相應組分，在酵母細胞中表達這種蛋白可以建立更為復雜的類似于“人源化酵母”的病毒感染體系;高通透性細胞膜酵母株和細胞膜主要轉運泵缺失酵母株的建立則使化合物更易進入細胞，提高了抗病毒藥物在酵母體系中的篩選效率［7］。

酵母的核糖體較哺乳動物的小，但二者結構非常相似，都含有HCV(丙肝病毒內部核糖體進入位點)序列結合位點，40S亞基同源性達60%［8］。在不含翻譯起始因子、只含HeLa細胞核糖體、酵母細胞延伸因子1A、2和大量氨酰tRNA的重組系統中，HCV IRES介導的翻譯仍可發生［9］。利用雙順反子表達載體pFGAL4，在酵母細胞中能夠檢測到 HCV IRES的翻譯活性［10］。pFGAL4載體由多重表達質粒改建而成，含有一個磷酸丙糖異構酶強啟動子，以保證螢火蟲熒光素酶基因和GAL4基因雙順反子mRNA的高水平表達。在含有IRES的順反子區域，Gal4轉錄因子是該區信號放大的保證。即使在只有少量的第二順反子表達、即細胞中僅存在少量活性Gal4分子的情況下，Gal4誘導型啟動子也會啟動大量的次生報告基因轉錄，使信號成比例放大。這種雙順反子表達系統利用了酵母在進化過程中自然形成的半乳糖代謝調節通路，嚴格準確、結果可靠。通過測定裂解產物中 -gal/luc酶活性比值和活細胞在選擇性SD培養基(缺乏腺嘌呤和組氨酸，富含組氨酸合成的競爭性抑制劑3-AT)上的克隆形成率判斷得知HCV IRES在酵母中仍有起始翻譯的活性。為進一步明確HCV IRES功能，篩選新型抗病毒藥物提供了新的模型。

此外，酵母雙雜交系統是研究蛋白相互作用的有利工具，利用該系統已檢測到了多種病毒蛋白與宿主蛋白的相互作用［11］，加深了人們對病毒致病機制的了解。

2 秀麗隱桿線蟲

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)作為模式生物早在40多年前由Sydney Brenner博士提出，它是由單細胞生物進化而來的最簡單的多細胞模式生物。成體線蟲長約1 mm，為雌雄同體。可在瓊脂培養基上培養，以大腸桿菌為食。大約含有1 000個體細胞，細胞形態和遺傳背景清楚。繁殖數200～300，25℃兩天可長為成體。低溫液氮冷藏可保存數年。線蟲基因組大約包含兩萬個基因，其中60%與其它物種的已知基因具有同源性。多種病毒可以感染線蟲，并在線蟲體細胞內復制和裝配，RNA病毒基因可被經典的RNA干擾途徑沉默［12］。盡管線蟲不產生獲得性免疫且沒有類似的巨噬細胞和嗜中性粒細胞，從整體水平研究宿主與病原體相互作用仍是良好的模型。

近年來廣泛研究的RNA干擾現象，是否為哺乳類抗病毒的防御機制未見定論，使用沒有免疫系統的線蟲進行研究，解決了上述問題。用水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)感染 RNAi機制缺陷的線蟲突變體，可產生大量的病毒;而感染加強RNAi反應的突變體，病毒顆粒的產生被抑制［13］，表明 RNAi的機制與抗病毒免疫密切相關。使用另一種具有廣泛宿主，能在酵母、植物、昆蟲和哺乳類細胞中復制的獸棚病毒(flock house virus)感染線蟲，也得到了相似的結論［14］。進一步研究表明，線蟲除了表達 dicer酶外還編碼三種dicer相關的解旋酶(drh)，此種酶與哺乳動物中能夠廣泛激活先天性免疫反應的RIG-I樣RNA解旋酶受體關系密切。在drh-2突變的線蟲中，外來雙鏈RNA介導的RNAi和病毒復制子介導的RNAi均增強，但在drh-1突變的線蟲中，外源性 RNAi卻無變化，提示外源性和病毒性RNAi途徑在基因水平存在差異［15］。

HSV VP16蛋白的作用靶點是一類小而關鍵的基因家族，包括哺乳動物中的 HCF-1、HCF-2和線蟲中的Ce HCF-1，它們在分子水平高度保守。HCF-1是單純皰疹病毒宿主細胞因子，在HSV感染的細胞中，HCF-1與病毒蛋白VP16相互作用，共同促進DNA–蛋白質轉錄激活復合物的形成。hcf-1基因缺陷的線蟲不能形成VP16介導的復合物，說明線蟲中的Ce HCF-1是 HSV VP16作用的唯一靶點［16］。HCF與HSV VP16的相互作用在多種動物中的保守性，一定程度上反映了自然選擇和病毒感染對細胞進化的共同影響。

3 黑腹果蠅

果蠅(Drosophila melanogaster)在分類學上屬于昆蟲綱雙翅目，生活周期包括卵、幼蟲、蛹和成蟲四個完全變態的發育階段，其中幼蟲又分為一齡、二齡及三齡，從初生卵發育至新羽化的成蟲大約為10 d。清晰的遺傳背景和便捷的遺傳操作使其成為一種理想的模式生物，廣泛應用于發育生物學、神經科學、生物化學和分子生物學等領域［17］。

相對于酵母和線蟲而言，果蠅已具有與人NF-kB免疫信號通路相類似的抗病毒Toll通路。HIV的輔助蛋白Vpu，通過與 SCF復合體的相互作用而干擾蛋白的降解，將Vpu基因轉化到果蠅的脂肪細胞中，可抑制Toll信號通路的活化［18］。在HIV感染早期起作用的Nef蛋白的功能，仍存在爭議。把Nef基因轉化到果蠅中，發現Nef不僅參與細胞增殖的調解，同時也誘導 Caspase依賴的細胞凋亡;Nef的功能與活化JNK信號通路，抑制NF-kB免疫反應有關［19］。把HIV的Tat蛋白注射到果蠅的胚胎中，觀察到Tat與微管的結合，干擾細胞周期M期的運行，明顯增加多倍體和異倍體的細胞［20］，此后在哺乳動物細胞中也檢測到Tat的相似作用。表達SARS冠狀病毒3a蛋白的果蠅可出現粗眼表型，利用這種轉基因模型發現3a蛋白參與了細胞內依賴網格蛋白的內吞作用，并可能通過調節細胞色素 C水平和caspase活性誘導細胞凋亡［21］。而在FHV感染的果蠅細胞中發現凋亡抑制因子DIAP明顯減少。通過RNAi方式抑制 diap1，細胞迅速凋亡，穩定轉染diap1抑制caspase活性則可阻止FHV感染引起的凋亡。由此推斷病毒誘導的凋亡也可能是通過改變細胞中凋亡抑制因子的水平和活性來實現的［22］?？傊?，研究病毒蛋白對整體動物的影響，果蠅是一種比較適合的模型［23］。

隨著果蠅中大量人類致病基因同源序列的發現以及對轉基因果蠅的研究，果蠅已被廣泛用于闡釋機體針對病毒的多種先天性免疫機制。研究發現，果蠅對Nora病毒的感染具有閾值依賴現象［24］：高滴度病毒感染可產生穩定的持續感染，而低水平病毒感染后可被完全清除。而且這種閾值依賴現象在RNAi通路突變株、Toll和 Jak-Stat通路突變株中仍然存在。這種RNA病毒不受RNAi機制影響且對其他免疫通路也不敏感，尚需進一步探索。

4 斑馬魚

斑馬魚(Danio rerio)作為模式生物用于研究脊椎動物的發育已有20多年的歷史。其特點是體型小，生長快，幼體可在24 h孵化，可以生長在96孔板中，生命周期短且早期胚胎透明易于觀察，飼養成本是小鼠的1% ～1‰。盡管利用細胞培養及線蟲、果蠅模型可以解決一些病原體與宿主反應的基本問題，但是由于缺乏脊椎動物復雜的免疫系統，這些模型對哺乳動物體內疾病進程的模擬程度有限［25］。而利用斑馬魚研究病原體-宿主相互作用可以很好地補充無脊椎動物模型和小鼠模型的不足。一方面，斑馬魚具有與哺乳動物類似的免疫因子和通路，不僅具備B淋巴細胞、T淋巴細胞、抗原提呈細胞和能產生活性NO和活性氧自由基的吞噬細胞，還具有體液免疫的基本要素如補體等，以及類似于哺乳動物Toll樣受體(TLR)和Nod樣受體的同源蛋白，在微生物感染后可以激活特定細胞因子的表達［26］。另一方面，斑馬魚具有操作簡單、成本低廉、生長周期短、基因背景清楚等特點，隨著對轉基因和基因敲除魚研究的不斷增加，利用斑馬魚建立細菌和病毒的感染模型備受關注。利用相差顯微鏡可以觀察到斑馬魚的吞噬細胞將注入胚胎的細菌吞噬并摧毀的整個過程［27］;結核分枝桿菌感染的斑馬魚可以模擬人的結核病，產生肉芽腫樣變［28］;葡萄球菌、鏈球菌和李斯特菌也有相應的斑馬魚模型［29］。目前利用斑馬魚建立了傳染性造血器官壞死病病毒(infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV)、傳染性胰臟壞死病毒(infectious pancreatic necrosis virus in trout IPNV)、神經壞死病毒、病毒性出血性敗血癥病毒、鯉春病毒血癥病毒等魚類病毒感染模型，病毒感染方式有體表吸入，腹腔注射等［30］。

利用斑馬魚研究免疫系統的功能有很多優點，例如可以檢測淋巴組織的早期發育，可以有效進行定點突變并對表型突變株進行大規模篩選。胞漿中的RIG-I樣受體(RLRs)和線粒體中的抗病毒信號蛋白(MAVS)在抗病毒干擾素的產生過程中有重要意義。魚類細胞線粒體中也存在與MAVS同源的蛋白，其誘導產生干擾素的機制與哺乳動物細胞類似［31］。研究MAVS缺失突變的魚細胞發現N-端的CARD樣結構域和C-端的跨膜結構域是維持MAVS信號轉導功能所必需的，而中部富含脯氨酸的區域是非必需的。

5 結語

綜上所述，目前利用小型模式生物對病毒的研究主要包括：通過闡明模式生物自然病原的感染機制了解病毒致病的通用途徑;用于動物抗病毒機制的比較學研究和進化研究;以某種基因的插入或缺失突變體作為整體模型，系統地研究基因或蛋白在病毒侵染過程中的作用特點;通過表達轉入的病毒基因篩選抗病毒藥物等多個方面。不同的小型模式生物與人類的親緣關系差別較大，需要在比較基因組學和功能學研究的基礎上進行選擇。例如，哺乳動物TLRs和節肢動物的Toll家族有明顯差別。前者可直接識別PAMP，而果蠅的 Toll受體則通過內源性蛋白間接地識別PAMPs;而作為脊椎動物的硬骨魚TLR則和與其同源的人類基因產物具有相同的功能［32］。其中，TRL5都是鞭毛蛋白的受體、TRL3能識別相同的配體且都具有識別RNA的作用，在抵抗病毒感染的先天性免疫中發揮重要作用。

合理地選擇小型模式生物，不僅可以在整體動物中觀察病毒與宿主的相互作用、彌補細胞系研究的不足而且能夠較早地進行抗病毒藥物的體內篩選，降低藥物研發的成本，有利于縮短研究周期、加快研究進度，減少實驗室感染的風險?？傊?，小型模式生物在病毒學研究中具有廣闊的應用前景。

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Application of Small Model Organisms in Research on Viral Mechanisms

SHEN Cong，HE Qi-yang
(Institute of Medical Biotechnology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100050，China)

Small model organisms such as yeast，nematodes，fruit fly and zebrafish have been widely used in biological research.They are used in research of viral mechanism and led to new understandings of virus-host interaction and antiviral immune mechanisms.The present review summarizes the versatility of these animal models and their main contributions in the elucidation of virus mechanisms.

Model organisms;Virus;Yeast;Nematode;Fruit fly;Zebrafish

R33

A

1671-7856(2011)02-0069-05

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.02.16

2010-10-18

科技部“重大新藥創制”綜合性大平臺項目(2009ZX09301-003)。

沈琮(1985-)，女，博士生，研究方向：微生物與生化藥學。E-mail：shencyky@163.com。

何琪楊，男，教授，博士生導師，研究方向：微生物與生化藥學。E-mail：qyh2000bj@yahoo.com.cn。