有機磷農藥長期低劑量暴露致認知功能損傷的研究進展

閆長會，檀德宏，彭雙清

(1.軍事醫學科學院疾病預防控制所毒理學評價研究中心，北京 100071;2.軍事醫學科學院毒物藥物研究所國家北京藥物安全評價研究中心，北京 100850)

目前，農藥已經成為人們提高農作物產量和日常生活殺蟲的必需品，而有機磷農藥(organophosphate pesticides，OPs)因其廣譜、高效的特點，逐漸取代有機氯農藥，成為世界范圍內應用最廣泛、用量最大的一類農藥。流行病學資料表明，長期接觸低劑量OPs能夠影響中樞神經系統的高級認知功能，其作用機制尚不明確，本文就長期低劑量OPs暴露致認知功能損傷的表現以及可能作用機制的國內外新進展進行簡要概述。

1 有機磷農藥誘發認知功能損傷的主要表現

OPs及其主要代謝產物通過抑制乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)活性而發揮神經毒性作用。環境中OPs可通過消化道、呼吸道和皮膚等途徑進入人體，吸收后迅速分布到全身各器官組織，有機磷的氟和氰等基團，其穿透血腦屏障的能力較強，所以OPs及其代謝物易與腦內的AChE結合，使AChE磷酸化，導致其催化活性受抑制;由于乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)是神經突觸的信號傳遞介質，AChE活性被抑制后，ACh不能被及時分解而在神經突觸間隙內堆積，引起一系列神經毒性作用。短期內大量暴露，產生急性毒蕈堿樣、煙堿樣作用及中樞神經系統癥狀，而長期低劑量接觸OPs在人體內蓄積引發慢性中毒，可能導致中樞神經系統的持久損傷。

隨著OPs在世界范圍內的廣泛使用，大量的OPs排放到大氣和土壤等自然環境，造成大面積農田和水源等不同程度的污染，直接影響食物和飲水安全，尤其是果蔬中殘留農藥使人體處于OPs長期暴露狀態。流行病學資料表明，OPs長期低劑量接觸影響中樞神經系統的高級認知功能，表現為神經精神改變、自主神經功能障礙及記憶、語言和視覺注意力等認知功能障礙［1］。如:Stephens等［2］研究發現，與正常人群相比，職業性接觸OPs的工人學習、記憶功能以及注意力明顯下降;在溫室工作接觸OPs的女工，工作季節結束后表現出學習和記憶功能下降癥狀［3］。高濃度OPs暴露地區的兒童在粗略運動、精細運動以及社會適應能力等方面的評分明顯低于低暴露地區兒童［4］;對OPs暴露孕婦進行流行病學追蹤調查顯示，其子女出現明顯的智力發育指數和運動發育指數緩慢、注意力缺陷及多動癥等問題［5］。同時農藥污染嚴重地區，神經退行性疾病(如老年癡呆和帕金森病等)發病率明顯升高［6］。可見，長期低劑量暴露OPs能夠引起中樞神經系統高級認知功能的損傷。

2 有機磷農藥誘發認知功能損傷的可能作用機制

2.1 機體對乙酰膽堿的耐受

ACh在神經系統高級認知功能中發揮著重要作用，而OPs急性中毒致神經毒性的主要原因是抑制AChE，因此傳統的研究多集中在OPs對膽堿能遞質系統的影響。低劑量OPs長期暴露，中樞神經膽堿能細胞內的AChE亦將處于輕微的持續抑制狀態，腦內ACh含量維持在較高水平。機體為適應這種ACh高濃度狀態，一方面，膽堿能受體將產生“負向調節”，表現為M受體數目減少、親和力降低，最后機體處于對ACh耐受狀態;另一方面，長期低劑量OPs暴露，機體對ACh的合成也將逐漸減少。機體通過膽堿能受體下調和ACh合成減少從而產生耐受可能是OPs長期低劑量暴露人群出現認知功能損傷的一個重要原因。

突觸后膜的M受體在學習記憶等認知功能過程中起重要作用，M受體的表達下調與認知功能障礙密切相關，OPs暴露后腦內膽堿能受體進行“負向調節”，這一點已經得到很多實驗證實［7－10］。Schwab 等［7］給予大鼠乙拌磷(disulfoton)2 mg·kg－1染毒后，大鼠腦中M受體的［3H］二苯羥乙基奎寧酯結合顯著性下降。Fitzgerald等［8］給予大鼠乙拌磷2 mg·kg－1染毒，采用［3H］標記M1和M2受體，發現染毒期間，大鼠腦組織皮質、海馬、紋狀體等部位M1和M2結合數目均有相應下降，因海馬－邊緣系統中有豐富的膽堿能纖維和膽堿敏感細胞及受體，該現象在海馬部位尤其明顯。

腦內ACh的變化主要反映膽堿能神經元的活動，與學習記憶密切相關的皮質和海馬等腦區的ACh主要來源于基底前腦膽堿能神經元。研究發現，ACh是與學習和記憶最為密切的神經遞質，腦內ACh的變化與認知過程密切相關，如在學習與記憶、空間工作記憶、注意力、自發運動和探究行為等認知活動中，基底前腦膽堿能神經元被激活，腦內ACh的釋放也隨之改變。而膽堿功能不足，可引起記憶、識別能力明顯減弱［11］。研究表明，ACh的含量隨著年齡的增加而下降，與青年相比，老年人腦內ACh的含量下降達30%。一些退行性疾病如老年癡呆患者在學習和認知方面存在明顯缺陷，且隨病情發展呈進行性下降，同時患者海馬中的ACh水平也明顯降低，含量下降可達70%，可見ACh含量的下降可能是低劑量OPs長期暴露誘發認知功能損傷的原因之一。

2.2 非膽堿酶抑制

由于神經遞質在神經系統發育成熟期間參與軸突的生長、分化和可塑性調節中起重要作用，而AChE抑制是OPs中毒的主要靶標，因此對于OPs誘發的神經毒性，以往的研究多集中在OPs對中樞神經遞質系統的影響。傳統的研究觀點認為OPs能夠影響中樞神經系統乙酰膽堿、多巴胺和5－羥色胺遞質的含量和傳遞，降低神經元活性和受體的表達。然而，低劑量OPs暴露對AChE沒有明顯抑制，對神經遞質亦無明顯影響，如 Moser等［12］研究發現，毒死蜱1 mg·kg－1連續染毒1年對大鼠腦AChE活性沒有明顯影響，染毒動物卻出現空間記憶損傷，因此，OPs暴露引起的認知功能損傷不能僅用AChE抑制來加以解釋。學習記憶功能的改變不僅受到突觸可塑性和學習記憶相關信號系統調節的影響，也與神經細胞骨架的組裝以及神經細胞的發生等密切相關。近年來的研究表明，非膽堿酶抑制機制在OPs誘發的神經毒性中越來越發揮重要作用。

2.2.1 學習記憶相關信號通路的激活

短串高頻電刺激海馬興奮性傳入神經時，海馬突觸傳遞可在數秒鐘內增強，其增強效果能持續數小時至數周，此現象稱為突觸長時程增強(long term potentiation，LTP)。LTP是研究學習、記憶的重要分子指標，易化LTP的誘導可改善老年大鼠的記憶能力，而阻斷LTP的誘導，可影響海馬依賴性學習行為的獲得［13］。LTP的產生和維持與許多遞質及受體有關，也涉及到許多信號通路。目前研究認為LTP的誘發和維持主要與腎上腺素能受體(腺苷酸環化酶，絲裂原活化蛋白激酶通路)、一氧化氮合酶(鳥苷酸環化酶，蛋白激酶G，N－甲基天冬氨酸受體)、多巴胺受體(腺苷酸環化酶，絲裂原活化蛋白激酶通路)、親代謝性谷氨酸受體(蛋白激酶C，絲裂原活化蛋白激酶通路)等信號途徑的調控有關。而在不抑制AChE活性的劑量暴露下OPs可以通過激活不同的信號通路而影響細胞的復制、分化，DNA合成，軸突、樹突的發生，甚至誘發細胞的凋亡等。

對于低劑量OPs長期暴露誘發認知功能損傷，目前研究比較多的途徑是 N－甲基天冬氨酸受體(N－methyl－D－aspartate receptors，NMDAR)－細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)信號通路。OPs暴露后，NMDAR激活一系列生化過程包括蛋白酶激活、磷脂酶激活等，最終使cAMP效應元件結合蛋白(Ca2+/cAMP response element binding protein，CREB)磷酸化，從而實現對LTP的調控［14－15］。而ERK1/2途徑是介導細胞產生反應的細胞內重要的信號轉導系統，參與了細胞生長、發育、分裂、死亡以及細胞間功能同步等多種細胞生理過程的調控［16］。Rosenblum等［17］發現乙酰膽堿神經元的學習記憶功能是由ERK1/2途徑介導的。OPs的暴露直接或間接激活M受體致NO產生，NO可以直接激活NMDAR。因此，OPs可能間接地激活了NMDAR－ERK1/2途徑，從而對LTP進行調控。

Tan等［18］研究發現，毒死蜱對體外培養神經細胞的毒性作用與ERK1/2有關，染毒后細胞內的ERK1/2大量激活會導致細胞損傷，而該劑量對AChE的活性沒有影響;Schuh等［19］用不抑制AChE活性劑量的毒死蜱處理原代培養的腦皮質細胞，CREB磷酸化表達增加，而CREB的磷酸化在長時程記憶的調控中具有非常重要的作用［20］，說明 ERK和CREB信號通路的調控是不依賴于AChE活性而存在的。目前對于ERK和CREB信號通路在OPs致認知功能損傷中的調控機制還有待于進一步的研究，闡明這些調控分子在OPs非膽堿抑制情況下致認知功能損傷中具體作用，將有助于預防和治療環境低劑量OPs暴露致認知功能的損傷。

2.2.2 神經元細胞骨架的紊亂

細胞骨架不僅決定神經細胞的形態結構，而且與細胞內各種細胞器及生物大分子的運輸、信號轉導、細胞分化及神經系統發育等細胞生命活動過程密切相關。神經元細胞骨架在學習記憶等高級認知功能中起重要作用，許多退行性疾病的發生均與骨架蛋白的異常表達有關，如早老性癡呆患者的神經元中可見到大量損傷的神經元纖維，神經元中微管蛋白的數量并無異常，但發生微管聚集缺陷，并存在tau蛋白的積累。神經絲(neurofilament，NF)是一種較豐富的細胞骨架成分，研究證實帕金森病和早老性癡呆患者腦中均能觀察到NF的異常磷酸化［21］，引起NF亞單位的過度表達或缺失，從而影響NF的動態平衡，最終導致NF在軸突和核周的聚集、軸突變性和軸突再生的延誤。

神經細胞內微管、微絲和中間絲等細胞骨架的動態結構及功能受多種蛋白分子的調控，根據細胞生理的需要，骨架蛋白表現聚合或解聚，形成微管和微絲的組裝或去組裝，若組裝與去組裝保持平衡狀態，則維持穩定的細胞骨架結構。研究顯示，OPs染毒后NF mRNA水平變化不明顯，但NF含量明顯減少，推測OPs的暴露可能影響了NF的降解［22］。在正常生理情況下，NF在軸突末梢部分被蛋白降解酶降解，其中研究比較多的是鈣蛋白酶，OPs染毒后神經系統中NF含量減少的同時伴隨鈣蛋白酶含量明顯升高［23］說明OPs暴露能夠影響NF的降解。

神經元微管在學習記憶中起重要作用，微管的組裝與去組裝能夠影響學習過程。經過學習記憶訓練的動物腦中微管蛋白含量明顯升高，達對照組3倍。微管抑制劑秋水仙堿則明顯抑制動物學習記憶能力，引起大鼠水迷宮和輻射迷宮等行為的障礙，其原因可能與其暴露后微管蛋白的聚合受到影響，即阻斷微管蛋白的聚合反應使它無法聚合成微管，從而影響學習記憶過程［24］。在細胞內還存在一些參與微管裝配的輔助蛋白，稱為微管相關蛋白(microtubule－associated protein，MAP)，在細胞中起穩定微管結構、促進微管聚合和調節微管裝配的作用，這在神經細胞中尤為突出。例如神經元MAP2有3種不同的亞型:MAP2A，MAP2B和MAP2C。OPs染毒后大鼠海馬中的MAP2A和MAP2B的含量明顯減少［25］，說明OPs可以通過干擾微管的組裝與去組裝的平衡而影響學習記憶功能。

2.2.3 海馬神經發生的抑制

海馬屬大腦邊緣系統，是與認知功能有關的重要腦區，其中內嗅－海馬環路(CA3→CA1→下腳→前下腳→內嗅區→齒狀回→CA3)與新近記憶痕跡有關，沖動在這些閉合環路中的循環反復，是短時記憶的基礎。海馬發揮正常的學習記憶功能需要有完整的組織結構。在生命過程中，海馬結構在不斷地更新修復，神經祖細胞(neural progenitor cell，NPC)對這種更新修復起主要作用。NPC具有自我更新的能力以及高度分化的潛能，平時處于潛伏狀態，而在神經元損傷后激活，可以分化成神經元對受損細胞進行補充。在成年動物海馬齒狀回顆粒下區存在NSC，為海馬維持學習記憶功能提供了保障［26］。

近年來，越來越多的研究發現成年動物大腦中仍存在神經發生，即中樞神經系統的NPC能夠不斷地增殖分化而產生新的神經元和神經膠質細胞。而神經發生的主要區域之一就是海馬齒狀回顆粒細胞下層。海馬齒狀回顆粒細胞下層的NPC遷移到顆粒細胞層，逐漸分化為顆粒細胞，與其他神經細胞形成突觸聯系，并整合到海馬功能的神經環路中，這一過程大概需要4～6周的時間，而完全成為成熟的顆粒細胞需要8周的時間。這些新生神經元，尤其是3～4周齡階段即開始參與利用先前的記憶等學習記憶功能活動，因此，在長時程記憶中具有非常重要的作用，尤其是在依賴于海馬的空間記憶中具有不可取代的作用。動物實驗結果表明，參與空間記憶的神經元中4～8周的新生神經元是成熟神經元數量的2～3倍［27］，用低劑量的射線殺傷新生神經元后，第1周動物空間記憶功能沒有明顯的改變，而2～4周后動物表現出明顯的空間記憶障礙，說明新生神經元在長時程記憶中具有非常重要的作用，新生神經元的缺失可以導致動物出現長時程記憶障礙。流行病學調查的結果顯示，工人在工作季節接觸OPs后認知功能并不發生改變，而在OPs暴露后的一段時間(1～2個月左右)反而出現了認知功能損傷［2－3］。因為不同時期的NPC在海馬的學習記憶中發揮不同作用，其對OPs的敏感度亦不相同，而神經發生與學習記憶障礙在時間上的一致性提示神經發生的抑制可能是OPs致長時程記憶障礙的因素之一。

2.2.4 氧化應激的誘發

氧化應激一直被認為是OPs中毒的重要機制之一，很多實驗研究表明OPs通過氧化應激反應產生氧化損傷作用而對神經細胞產生毒性，并誘發神經細胞凋亡［28－29］。Slotkin等［30］實驗研究發現毒死蜱對神經細胞PCI2產生脂質過氧化作用，在未分化的細胞內硫代巴比妥酸(thiobarbiturie acid)還原物的含量升高，通過抗氧化劑和維生素C和維生素E的作用可阻止硫代巴比妥酸還原物細胞內含量增加。Yu等［31］也發現毒死蜱染毒小鼠的視神經細胞發生凋亡，神經組織抗氧化能力降低，超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶含量減少。流行病學資料顯示OPs急性暴露人群血清內抗氧化物質(超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等)含量明顯減少，而脂質過氧化終產物(丙二醛等)含量明顯增加［32－33］。

然而對于長期低劑量OPs暴露后動物體內的氧化應激相關基因在轉錄水平卻沒有明顯改變［34］，同時，一些體內動物實驗結果也表明OPs暴露并不誘發氧化應激。Hazarika等［35］發現大鼠OPs重復染毒并未檢測到氧化應激和細胞膜的脂質過氧化，da Silva等［36］也證明母小鼠孕期馬拉硫磷染毒對母鼠和仔鼠腦內氧化和抗氧化系統沒有影響。因此，氧化應激可能是急性和高劑量OPs暴露致神經毒性的重要原因，而其在低劑量重復暴露OPs致認知功能損傷中的作用尚有待于進一步研究。

3 結語

因OPs高效、廉價和廣譜的優勢，其在我國及世界大部分地區的大量使用，勢必造成對環境的持續污染，這種長期、低劑量的OPs暴露對人類健康的威脅值得關注。近幾年來，許多非特異的中樞神經系統癥狀(焦慮、抑郁、易激惹、情感淡漠等)和神經退行性疾病(老年癡呆、帕金森病等)的高發被懷疑與OPs長期低劑量暴露有關。這種長期環境暴露對中樞神經系統的認知功能的損傷還未展開深入研究。目前OPs致神經毒性的非膽堿酯酶抑制機制逐漸受到廣泛關注，尤其是ERK/CREB等學習記憶相關信號系統的激活，以及神經細胞骨架的降解和神經發生的抑制等。這些問題的深入研究，將從不同角度探討OPs低劑量染毒致認知功能損傷的可能分子機制，有利于全面認識OPs環境暴露導致的神經毒性的可能作用機制，將為OPs致認知功能損傷的防治提供可靠理論依據。

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