H.E染色和普魯氏染色在動物鐵過負(fù)荷診斷的比較

江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 張 靜

動物鐵中毒主要表現(xiàn)為嘔吐、腹痛、腹瀉、急性腸壞死等。其原因在于動物的腸屏蔽功能不能有效防止鐵的過量吸收。研究表明，豬仔體內(nèi)含鐵量超過400 mg/頭時會導(dǎo)致死亡；綿羊若含鐵量2.5 g就會引發(fā)急性鐵中毒，0.5 g/kg則會導(dǎo)致瘤胃弛緩、腹瀉以及腎機(jī)能障礙，慢性中毒的綿羊3周內(nèi)就會死亡。當(dāng)前隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，飼料中添加鐵制劑成為一種常態(tài)，動物鐵中毒或者鐵過負(fù)荷的現(xiàn)象時有發(fā)生。診斷和解決動物鐵中毒和鐵過負(fù)荷成為當(dāng)前養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的需要，然而針對鐵過負(fù)荷和鐵中毒的研究卻非常稀少，本試驗(yàn)研究比較了鐵過負(fù)荷豬的臟器H.E染色和普魯氏染色變化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物與試驗(yàn)材料 10頭臨床診斷判定為鐵過負(fù)荷病豬。

試驗(yàn)材料：Leica冰凍切片機(jī)、PM-10AD顯微鏡、數(shù)碼相機(jī)。實(shí)施H.E染色以及普魯氏染色法所需要的各種器皿以及藥品。

1.2 試驗(yàn)方法 采用病理解剖學(xué)觀察法：（1）解剖并取該淋巴結(jié)，將其被膜上的脂肪組織剝除，接著將脂肪組織切片，在生理鹽水中洗滌后取圖像。（2）將其放入由50 mL濃度為5%的亞鐵氰化鉀和50 mL相同濃度的鹽酸配置成的普魯氏蘭染色液中進(jìn)行15 min染色，當(dāng)淋巴結(jié)出現(xiàn)藍(lán)色反應(yīng)時將其取出并沖洗，吸水紙吸干水分后觀察和采集圖像。（3）分別采用淋巴結(jié)、肝臟、脾臟、肺臟以及腎臟的組織塊，用生理鹽水洗滌，然后借助Leica冰凍切片機(jī)專有的組織粘附劑將上述各個組織塊粘在凍頭上，并在-25℃進(jìn)行切片，每一切片的厚度為5 μm。切片成功后將其放在干凈的載玻片上并即刻用100 mL/L的福爾馬林固定30 s左右，然后再用濃度為950 mL/L的乙醇再固定30 s。每種臟器都要做兩組切片，其中一組切片用H.E染色，另一組用普魯氏染色。最后用酒精脫水后并采用中性的樹膠封固切片，之后移至顯微鏡下進(jìn)行觀察并采集圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 病理解剖學(xué)變化 鐵過負(fù)荷機(jī)體內(nèi)的淋巴結(jié)的顏色隨著鐵過負(fù)荷程度的不同而呈現(xiàn)出從棕黃色到棕褐色的不同色澤。鐵過負(fù)荷程度越高，其在普魯氏染色之后呈現(xiàn)的藍(lán)色越深，反之鐵過負(fù)荷程度越低，其呈現(xiàn)出的藍(lán)色越淺。

2.2 組織病理學(xué)變化

2.2.1 淋巴結(jié) 通過對H.E染色標(biāo)本觀察可知，病變之后的淋巴結(jié)被膜、小梁、實(shí)質(zhì)、淋巴小結(jié)、髓索以及髓竇內(nèi)巨噬細(xì)胞的數(shù)量劇增。在淋巴結(jié)的副皮質(zhì)區(qū)內(nèi)可以明顯觀察到網(wǎng)狀細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量減少，巨噬細(xì)胞數(shù)量增加，增加幅度甚至高達(dá)原來的幾十倍。巨噬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有鐵血黃素顆粒，這些顆粒的數(shù)量不等，顏色呈棕黃色。但是由于巨噬細(xì)胞吞噬了大量的鐵黃素顆粒，因此體積增大導(dǎo)致正常形態(tài)受損難以被識別。而在普魯氏蘭染色標(biāo)本中，可以觀察到巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)出由淡藍(lán)色到深藍(lán)色的不同顏色，而且其數(shù)量也比H.E染色多，所在位置也以周圍的淋巴組織和淋巴竇為主，被膜、小梁和淋巴結(jié)內(nèi)的數(shù)量則相對少一些。巨噬細(xì)胞大量集結(jié)在一起無法識別其清晰的輪廓，但是單獨(dú)存在的巨噬細(xì)胞還是比較清晰的并能夠識別。

2.2.2 脾臟 H.E標(biāo)本中的巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增多，體積變大，含有大量的鐵黃素顆粒。分布區(qū)域主要是邊緣區(qū)和脾索內(nèi)，其次是脾血竇和動脈周圍的淋巴組織鞘。普魯氏蘭染色標(biāo)本巨噬細(xì)胞的分布位置與H.E標(biāo)本大致相同，但前者巨噬細(xì)胞的數(shù)量更多而且更加清晰。巨噬細(xì)胞的體積隨著鐵黃素顆粒數(shù)量的增多而增大，顏色也隨之變深。

2.2.3 肝臟 肝臟組織的H.E標(biāo)本中枯否氏細(xì)胞數(shù)量大量增加，而且在其細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見鐵黃素顆粒肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性癥狀。普魯氏蘭染色標(biāo)本中的枯否氏細(xì)胞數(shù)量較前者更多，而且由于細(xì)胞都被染成藍(lán)色因此更易觀察和辨識。在肝臟的葉下靜脈中可以清晰地看到內(nèi)含鐵黃素顆粒的單核細(xì)胞，而這些單核細(xì)胞也可能是被肝臟轉(zhuǎn)移的細(xì)胞。同時可以觀察到肝細(xì)胞內(nèi)也有大量被染成藍(lán)色的鐵黃素顆粒。

2.2.4 肺臟 肺組織H.E標(biāo)本中，可以在肺泡膈中看到肺巨噬細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞的數(shù)量明顯增多，而且這些巨噬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)都含有鐵黃素顆粒。但是由于較小的結(jié)構(gòu)反差，因此在試驗(yàn)中不易識別。而在普魯氏藍(lán)染色標(biāo)本中巨噬細(xì)胞被染成藍(lán)色識別相較于前者較為容易。需要指出的是肺泡腔內(nèi)的塵細(xì)胞往往以聚集的團(tuán)狀物存在。

2.2.5 腎臟 H.E染色標(biāo)本中未發(fā)現(xiàn)吞噬有鐵黃素顆粒的巨噬細(xì)胞，在普魯氏蘭染色標(biāo)本中則可以發(fā)現(xiàn)血管球毛細(xì)血管之間的球內(nèi)系膜細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有鐵黃素顆粒。含有鐵黃素顆粒的巨噬細(xì)胞則主要存在于腎臟的間質(zhì)內(nèi)，不過數(shù)量稀少。

3 小結(jié)

3.1 鐵過負(fù)荷的病理解剖學(xué)診斷 診斷鐵中毒主要借助動物的病史和詳細(xì)的檢查：包括動物服用的鐵制劑的種類、數(shù)量以及時間都、血清鐵峰值水平、外周圍血白細(xì)胞數(shù)以及血糖水平。正鐵和蛋白質(zhì)組成的含鐵血黃素在病理狀態(tài)下是一種呈黃褐色的顆粒，在組織細(xì)胞內(nèi)則以黃褐色顆粒或者小塊的形式存在，當(dāng)實(shí)施普魯氏蘭試驗(yàn)時，會發(fā)生藍(lán)色陽性反應(yīng)。大量的臨床試驗(yàn)證明，只有鐵過負(fù)荷的動物淋巴結(jié)細(xì)胞才會含有鐵血黃素。本試驗(yàn)用普魯氏染色液對淋巴結(jié)組織塊進(jìn)行染色的方法，只需要15 min就能確切診斷該動物是否鐵過負(fù)荷。

3.2 鐵過負(fù)荷的組織病理學(xué)診斷 在H.E標(biāo)本中鐵黃素保持其原有的黃色至褐色的顏色變化范圍，沒有著色。盡管也可以在標(biāo)本中清晰顯示病理變化，但是H.E染色難以與其他黃色色素進(jìn)行區(qū)別，當(dāng)巨噬細(xì)胞中的鐵黃素顆粒較少時，鐵黃素的色澤往往會被蘇木素或者伊紅色素掩蓋，不能清晰的顯示出來。而采用普魯氏蘭染色液染色之后則可以避免該種現(xiàn)象出現(xiàn)，能夠通過對其染上藍(lán)色清晰顯示出淋巴結(jié)、肺臟、肝臟以及腎臟等組織細(xì)胞中含有的鐵血黃素。

總之普魯氏蘭染色和H.E染色能借助相應(yīng)細(xì)胞變色的原理解釋和反映動物鐵過負(fù)荷的現(xiàn)狀。但僅用于定性，不能對動物鐵負(fù)荷進(jìn)行定量檢測。