rAV-Tumstatin病毒載體對裸鼠膀胱移植癌治療作用的初探①

李 志 魏 巍 劉祿成 郭 航 張 明 楊 瀟 黃海龍

（吉林大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科,長春 130041）

·移植免疫學(xué)·

rAV-Tumstatin病毒載體對裸鼠膀胱移植癌治療作用的初探①

李 志 魏 巍 劉祿成 郭 航 張 明 楊 瀟 黃海龍

（吉林大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科,長春 130041）

目的:探討重組腺病毒攜帶腫瘤抑素（rAV-Tumstatin）對裸鼠膀胱移植癌的治療效果。方法:構(gòu)建裸鼠膀胱移植癌模型,隨機分為治療組和對照組,記錄腫瘤重量和體積,流式細胞儀（FCM）檢測腫瘤細胞周期和凋亡。結(jié)果:裸鼠膀胱移植癌模型構(gòu)建成功,rAV-Tumstatin病毒載體治療組移植性膀胱癌生長受到明顯抑制,腫瘤重量和體積明顯小于對照組（P＜0.01）,FCM檢測治療組腫瘤細胞G1-S期進程受阻,增殖率下降,凋亡率上升,與對照組相比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論:攜帶rAV-Tumstatin載體通過抑制腫瘤細胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡,發(fā)揮對裸鼠移植性膀胱癌的治療作用。

膀胱腫瘤;裸鼠·模型;腫瘤抑素;腺病毒載體

膀胱移行細胞癌（Transitional cell carcinomaof the bladder,BTCC）是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤[1]。目前膀胱癌發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)機制尚未完全明確,對其發(fā)生率居高不下和治療后多次復(fù)發(fā)的生物學(xué)基礎(chǔ)尚缺乏廣泛深入的研究。近年有研究指出:腫瘤抑素（Tumstatin）是一種內(nèi)源性的血管生成抑制因子與細胞凋亡啟動子,具有2個抗腫瘤活性區(qū),不僅通過特異性地抑制血管內(nèi)皮細胞蛋白合成導(dǎo)致內(nèi)皮細胞凋亡,使腫瘤新生血管形成受阻,還可抑制腫瘤細胞增殖并促進其凋亡,從而遏制腫瘤生長,有可能給腫瘤的治療帶來新的希望[2,3]。但目前尚未見到Tumstatin在BTCC研究方面的文獻報道。最近我們選用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建了rAV-Tumstatin病毒載體,并就其生物活性對BTCC細胞株T24的影響進行檢測,結(jié)果表明,rAV-Tumstatin在體外能抑制膀胱癌T24細胞株增殖并誘導(dǎo)其凋亡,對膀胱癌基因治療的研究具有一定的價值[4]。為進一步探索其在體內(nèi)的作用,本實驗以裸鼠移植性膀胱癌為模型,觀察重組腺病毒攜帶腫瘤抑素（rAV-Tumstatin）對腫瘤的治療作用,為其作為抗腫瘤的基因治療藥物應(yīng)用于臨床膀胱癌奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 rAV-Tumstatin病毒載體由本實驗室構(gòu)建[4]。人膀胱癌細胞株T24購自中國科學(xué)院上海細胞所。BALB/c裸鼠購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物研究所。細胞凋亡檢測試劑盒和流式細胞儀均為日本日立公司產(chǎn)品。

1.2 方法 ①裸鼠膀胱癌移植模型建立的方法步驟按參考文獻[5]所述,即苯巴比妥鈉麻醉后,無菌條件下F8號導(dǎo)尿管通過尿道插入膀胱,用酸性液體處理膀胱造成粘膜局部損傷,向損傷部位注入經(jīng)胰酶消化制成濃度為5×106ml-1的處在對數(shù)生長期的人膀胱癌細胞株T24懸液0.2ml。7天時開始成瘤,28天時對照組和治療組腫瘤分別生長至直徑1.5 cm和0.9 cm大小。②把開始成瘤的30只裸鼠隨機分為治療組（20只）和對照組（10只）,兩組每隔4天分別注入rAV-Tumstatin病毒載體治療和生理鹽水對比,5次20天為一個療程,療程結(jié)束后處死全部裸鼠,分離出瘤體,檢測腫瘤重量和體積。③采用FCM分別檢測腫瘤細胞周期和凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.5軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,腫瘤重量和體積及細胞增殖率和凋亡率以±s表示,組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠移植癌的生長情況 30只裸鼠種植人膀胱癌細胞株T24后7天開始觀察,膀胱黏膜損傷部位均有病灶形成,并經(jīng)病理檢查證實,瘤細胞種植成功率100%。第28天時處死裸鼠,分離出瘤體稱重,同時用游標卡尺測量腫瘤大小并計算瘤體積。治療組腫瘤重量為（1.28±0.47）克,體積為（1 097.64±283.75）mm3,空白對照組腫瘤重量為（2.17±1.58）克,體積為（2 459.38±1 649±1 374.15）mm3。治療組腫瘤的重量和體積明顯低于對照組,組間比較差異有顯著性（P＜0.01）,提示rAV-Tumstatin病毒載體對腫瘤生長有良好抑制作用。

2.2 癌組織中細胞凋亡率的變化 FCM結(jié)果顯示:rAV-Tumstatin病毒載體組治療后,腫瘤細胞凋亡率為（27.5±1.4）%,而未治療組即對照組只有（9.3±0.7）%,組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）,顯示rAV-Tumstatin病毒載體在體內(nèi)能夠通過誘導(dǎo)細胞凋亡,延緩腫瘤生長。

2.3 腫瘤細胞周期檢測 FCM檢測兩組裸鼠移植瘤的細胞周期結(jié)果是:治療組G0/G1期57.82%±3.91%,S期14.08%±21.73%,G2/M期6.38%±2.04%;對照組G0/G1期 39.04%±8.35%,S期26.19%±3.27%,G2/M期7.24%±5.08%。組間不同細胞周期比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）,表明rAV-Tumstatin病毒載體具有通過調(diào)控細胞周期使細胞G1-S期進程受阻從而抑制腫瘤生長的生物活性。

3 討論

裸鼠是嚴重免疫缺陷的小鼠,沒有異種間移植組織的免疫排斥反應(yīng),移植后細胞成活率高,在本實驗中成瘤率達到100%。在裸鼠膀胱內(nèi)移植并生長的人膀胱癌細胞株T24形態(tài)與人類的膀胱移行細胞癌形態(tài)具有驚人的相似,能保持原有的組織細胞形態(tài)與特征,所以實驗結(jié)果可能對臨床有一定的參考價值。

腫瘤抑素（Tumstatin）是 2000年由 Maeshima等[6]從腎小球基底膜中分離出來的一種內(nèi)源性血管生成抑制因子。是近年來發(fā)現(xiàn)的作用最強的血管生成抑制因子之一,對血管內(nèi)皮細胞具有特異性的抑制作用,已在腫瘤的抗血管生成治療中得到廣泛應(yīng)用。進一步的實驗證明,該蛋白除具有突出的抑制血管內(nèi)皮細胞增殖功能外,還具有明顯的誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的生物活性,故其作為腫瘤抑制基因在腫瘤治療中的作用和地位得到進一步重視和加強[7,8]。

本文作者選擇攜帶腫瘤抑素基因的重組腺病毒載體,觀察其對模型裸鼠膀胱移植癌的治療作用。實驗結(jié)果顯示:用rAV-Tumstatin病毒載體治療的裸鼠,其腫瘤重量和體積比對照組明顯降低（P＜0.01）,腫瘤細胞增殖率和凋亡率與對照組相比,差異也均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。實驗數(shù)據(jù)初步展示了Tumstatin基因?qū)β闶蟀螂滓浦舶┑牧己弥委熜ЧＴ摶蛞部赡艹蔀榕R床上治療膀胱癌的一個新的選擇。不過值得一提的是,動物與人基因型、表型、免疫力以及對惡變細胞監(jiān)督和清除的機理與能力存在差異,而且裸鼠膀胱癌模型的建立是一個被動的成瘤過程,人膀胱癌則是在自然條件下主動形成的,再者,兩種癌發(fā)生發(fā)展的微環(huán)境不同,所以本實驗成績能否真正為臨床帶來幫助,甚至成為膀胱癌病人的福音,無疑還需要做更多、更深入的工作。

1 Takushi U,Kazutaka H,Fumiatsu Oetal.Diagnosing the location of carcinoma in situ（CIS）of the urinary bladder using pirarubicin hydrochloride[J].Urol Int,2005;74:235-239.

2 Sudhakar A,Boosani C S.Inhibition of tumor angiogenesis by tumstatin:insights into signaling mechanisms and.implications in cancer regression[J].Pharm Res,2008;25（12）:2731-2739.

3 Eikesdal H P,Sugimoto H,Birrane Getal.Identification of am ino acids essential for the antiangiogenic activity of tumstatin and itsuse in combi-nation antitumor activity[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008;105（39）:15040-15045.

4 任 明,劉祿成,魏 巍etal.rAV-Tumstatin病毒載體構(gòu)建及其生物活性檢測[J].吉林大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）,2010;36（3）:453-456.

5 朱德淳,梁 新,劉祿成etal.荷瘤裸鼠膀胱癌原位模型的建立及VEGF siRNA轉(zhuǎn)染對腫瘤生長的影響[J].吉林大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）,2007;33（5）:860-862.

6 Maeshima Y,Colorado PC,Torre Aetal.Distinct antitumor propertiesof a typeⅣcollagen domain derived from basement membrane[J].Biol Chem,2000;75（28）:21340-21348.

7 Meng J,Ma N,Yan Zetal.NCR enhanced the anti-angiogenicactivity of tumstatin[J].JBiochem,2006;140（2）:299-302.

8 Lou YQ,Wang LH,Ma X Letal.Construction expression and characteri-zation of a new targeted bifunctional fusion:tumstatin15-132-TNF[J].IUBMB Life,2006;58（11）:647-652.

[收稿2010-08-16 修回2011-01-20]

（編輯 倪 鵬）

The cure effect of rAV-Tumstatin viral vector on bladder tansplanted tumor in nude m ice

LIZhi,WEIWei,LIULu-Cheng,GUOHang,ZHANGMing,YANGXiao,HUANGHai-Long.DepartmentofUrology,theSecondHospitalofJilinUniversity,Changchun130041,China

Objective:To investigate the cureeffectof recombinantadenoviruswhich carried with rAV-Tumstatin onb ladder transplanted tumor in nudem ice.Methods:Transplanted tumormodelof bladder canceron nudemicewas setup,and been divided into treated group and controlgroup random ly.Tumormass and volum were recorded.Tumor cell cycle and apoptosisweremeasured by FCM.Results:Transplanted tumormodel of bladder canceron nudem icewas setup successfu lly.Thegrowthof transplanted tumor among rAV-Tumstatin virusvector treated groupweremarkly suppressed.The tumormass and volumewere significantly smaller than control group（P＜0.01）.It showed cell cyclearrest on G1-Sphase in treated group,growth ratewere reduced and apoptotic indexwere increased.Therewere statisticly significance comparedwith control group（P＜0.01）.Conclusion:Vector carried with rAV-Tumstatin cou ld suppress tomor cell proliferation and induced its apoptosis.So ithad cure effecton transplanted bladder tumor.

Bladder cancer;Nudem ice·model;Tumstatin;Adenovirus vector

R373.14

A

1000-484X（2011）05-0438-02

10.3969/j.issn.1000-484X.2011.05.013

①本文為國家自然科學(xué)基金資助項目（30972981）

李 志（1962年-）,男,醫(yī)學(xué)學(xué)士,副教授,主要從事泌尿系腫瘤的治療研究。

·免疫學(xué)技術(shù)與方法·