中藥指紋圖譜研究與應用進展Δ

劉文，蔣世云

（廣西工學院生物與化學工程系，柳州市 545006）

中藥指紋圖譜研究與應用進展Δ

劉文＊，蔣世云#

（廣西工學院生物與化學工程系，柳州市 545006）

目的：全面系統地闡述中藥指紋圖譜的研究應用發展狀況。方法：查閱國內外文獻資料，對各種方法進行分析、歸納和總結。結果：中藥指紋圖譜分為中藥化學指紋圖譜和中藥生物指紋圖譜。中藥化學指紋圖譜中以色譜法最為常用，尤其是高效液相色譜法；生物指紋技術對藥材種類的鑒別具有高通量、大規模、準確性高等優勢，但不能鑒別藥材的道地性。技術聯用以獲得多維信息也是目前的主流。結論：建立中藥指紋圖譜質量控制體系，尤其是構建相關生物活性成分多維的指紋圖譜，是中藥材、半成品和成品質量控制標準的發展方向，將生物指紋技術配合主要藥效成分的測定用于中藥質量的控制是目前較為合理的方法。

中藥；質量控制；指紋圖譜；現代生物技術

中藥是我國一大國寶。現代科學研究表明，中藥的療效與其活性成分的種類、含量等有關，因此要實現中藥現代化，對中藥材、半成品和成品的質量控制標準必須以其有效成分的種類、含量等作為指標，才能保證中藥的“安全、有效、穩定、可靠”[1]。

中藥指紋圖譜是運用現代分析技術對中藥化學信息以圖形的方式進行表征并加以描述[1]，是一種綜合分析多種成分的有效手段。其具有系統性、特征性和重復性，顯示中藥質量控制標準的整體性與模糊性[1]，更具有科學性，因而受到國際上的認可。從中藥材到中成藥的生產過程中，每一步都有明確的控制指標，而指紋圖譜就是將這些指標圖形化、信息化，為生產者提供一雙明亮的“眼睛”，保證中藥生產各環節的質量，為中藥現代化保駕護航。

1 中藥指紋圖譜的研究與應用

中藥成分的復雜性決定其質量控制指標為非單一成分。為了獲得其有效的化學信息，中藥指紋圖譜應運而生。它是這些信息的綜合結果，能夠成為中藥自身的“化學條形碼”[1]。隨著邊緣學科新技術的不斷發現，出現了許多具有說服力的控制方法。為了獲得中藥全面的信息，可以采用多項儀器聯用。而且，隨著生物技術的發展，生物芯片以其高通量、大規模等特點在中藥質量控制中的應用也越來越廣泛。根據測定手段獲得的指紋圖譜可分為：中藥化學指紋圖譜和中藥生物指紋圖譜。

1.1 中藥化學指紋圖譜

1.1.1 光譜法 利用被測物質對光的吸收而被用于有機化合物分子的結構鑒定和對中藥有效成分的定性、定量分析。光譜法是近幾十年發展起來的科學技術，已成為中藥材真偽鑒別及質量控制的重要參考手段。以紫外光譜（UV）法、紅外光譜（IR）法和近紅外光譜（NIR）法最為常用。

UV法：用于化合物結構的鑒別和含量的測定。其光譜是電子光譜，形狀變化不大，不具備指紋特征，但可依據吸收峰的數目及峰的相對位置來鑒別中藥。邢旺興等[2]測定7種紅曲藥材甲醇提取液的UV光譜，并結合一階導數光譜，根據峰位置差異能夠鑒別不同品種的紅曲。

IR法：是鑒別化合物和確定物質分子結構的常用手段。其以宏觀的、非線性的分析理念和質量控制模式評價中藥的真偽優劣，具有無損鑒別、儀器通用等優點。成則豐等[3]測定不同產地野生、種植天麻與偽品芭蕉芋、芋及馬鈴薯的水平衰減全反射-傅里葉變換紅外光譜，并轉化為傅里葉自解卷積光譜，在4000～650cm-1內能簡便、準確地識別天麻及其偽品。而Fourier轉換紅外光譜法聯合二次衍射光譜及二維紅外光譜鑒定藥材，具有快速、易操作與很好的重現性[4]。

NIR法：由于試樣選擇性吸收不同頻率的近紅外光，導致透射的近紅外光線就攜帶組分結構的信息。NIR法具有快捷、不破壞樣品等優點，但必須采用一定的數據處理才能克服譜圖重疊多的缺點。趙龍蓮等[5]采集95個大黃樣品的近紅外漫反射光譜，用小波包熵進行特征提取和Fisher分類器相結合，其建模集與預測集的誤判率均低于采用主成分分析的結果，為其快速真偽鑒別提供了參考。

1.1.2 色譜法 是分離純化和定性、定量鑒別中藥成分的重要方法。利用樣品中各組分在互不相溶的兩相之間的作用力不同，使各組分達到分離。以高效液相色譜（HPLC）法、薄層色譜（TLC）法、氣相色譜（GC）法、超臨界流體色譜（SFC）法和高速逆流色譜（HSCCC）法最為常用。

HPLC法：是近幾十年發展起來的已成為中藥質量控制主要手段的一種分析方法，具有分離速度快、分離效率高、檢測靈敏度高等優點。周婧等[6]用HPLC法分析9個不同產地的西洋參得出圖譜中含有18個共有峰，并且與以6種人參皂苷為對照品的圖譜作相似度計算，結果均＞0.85，建立的指紋圖譜可作為該藥材評價、制定質量標準的參考。

TLC法：是一種經典的平面色譜方法。由于它的多路柱效應、樣品的靜態檢測、靈活的色譜后衍生化等特點，已成為中藥成分分析的一個首選方法。黎俊華等[7]用TLC法完善了溶栓丸的質量控制標準。而微乳色譜法鑒定藥材活性成分具有更高的靈敏度和更好的分離效果，且Rf值高的成分無擴散現象[8]。

GC法：是一種以氣體為流動相的分離技術，適用于揮發性成分或衍生化后揮發性成分的檢測，但只能分析低沸點物質。其具有簡單易行、可比性強等優點。鄭宵蓓等[9]測試分析18種半夏，以5種甾醇類成分為特征峰的指紋圖譜可作為其質量控制的方法。而儀器的聯用分析多種化合物具有一定的優越性。Qiu YQ等[10]用GC×GC-TOFMS和GC×GC-FID分析羌活中的化合物，結果表明四川的羌活成分明顯不同于其他地區。Adahchour M等[11]總結了2004－2006年GC-GC聯用的發展及應用。

SFC法：是20世紀80年代興起的以SFC為流動相的一種分離方法，適合不穩定的揮發性成分和脂溶性物質的提取分離。其具有提取率高、產品純度好、不破壞天然產物的活性及結構等優點。李云華等[12]用SFC獲得三七、田七花等的指效圖譜可作為其鑒別依據。

HSCCC法：是一種液-液分配色譜方法，因無不可逆吸附、兩相充分接觸而能獲得更好的分離效果。其具有操作條件溫和、分離效果好等優點。OuYang XK等[13]用HSCCC預分離雷公藤中4種主要的生物堿，以石油醚-乙酸乙酯-乙醇-水溶劑系統中的有機相作為固定相，水相作為流動相，一步分離就能達到很高的分離純度。由于HSCCC指紋圖譜包含更多的化學成分信息，研究證明其在中藥質量控制中具有可行性和低耗費[14]。

1.1.3 質譜（MS）法 中藥各成分分子在MS儀中被裂解為不同的碎片，成分不同則其圖譜顯示的碎片峰也不相同。但MS一般與色譜聯用以獲得多維信息特征譜。Lu HM等[15]用GC-MS分析34家制藥廠的340批魚腥草注射劑，以15種主要的共有成分作為特征峰所建立的指紋圖譜結合目前的質量保證標準，被建議作為其質量控制的依據。Ren MT等[16]用HPLC-ESI/TOF-MS同時檢測8種藥用金銀花中32種活性成分，并且檢測出6種未知活性成分，具有很高的選擇性和準確性。而數字圖像識別技術的使用為多維指紋圖譜的分析提供了一種新的途徑[17]。

1.1.4 核磁共振（NMR）法 是可以同時獲得化合物的多個結構信息、鑒別化合物結構的主要手段。其提取分離特征性化學成分總提取物，純化得到單體，使用結構鑒定與NMR研究，對指紋圖譜中的各特征譜線進行歸屬，實現對中藥質量的控制。具有較高的穩定性和重復性。核磁共振氫譜（1H-NMR）因其較高的靈敏度而被廣泛采用。時新剛等[18]研究北沙參的1H-NMR，根據有效成分特征共振峰來鑒別其真偽。

1.1.5 X射線衍射法 物質的組成、分子的構型等決定該物質產生特有的衍射圖譜，是各組分衍射效應的疊加，具有指紋性強、結果穩定可靠等優點。劉小平等[19]用此法獲得的指紋圖譜能快速鑒定六味地黃丸。X射線衍射二階導數指紋圖譜的出現克服了傳統衍射指紋圖譜峰重疊、峰形不明顯等缺點[20]。而X射線指紋圖譜專家系統網格的構建能提高中藥分析鑒定的效率[21]。

1.1.6 免疫測定法 具有簡單、快速、特異性高和可靠等優點。Morinaga O等[22]在聚醚砜（PES）膜上分離柴胡提取物中的柴胡皂苷并用抗SSA的單克隆抗體進行免疫染色，用美國國立衛生研究院（NIH）圖像分析軟件分析SSA及總柴胡皂苷含量，得到的結果與酶聯免疫吸附測定法相符。

1.2 中藥生物指紋圖譜

現代生物技術產生于20世紀50年代，已廣泛用于中藥質量控制。近年來許多新學科、新理論和新試驗技術不斷滲透到中藥鑒定領域，彌補了中藥鑒定和質量控制的一些不足，也展示了生物技術在該方面的重要性。

1.2.1 電泳技術 帶電樣品在惰性介質中于電場的作用下使組分分離成狹窄的區帶，用相應的方法記錄其區帶區譜或計算其含量。以蛋白質電泳、同工酶電泳和毛細管電泳較為常用。

蛋白質電泳：具有耗費低、重現性好等優點。可其圖譜主要靠肉眼比較，影響了結果的準確性。李桂蘭[23]電泳苦杏仁及混偽品的可溶性蛋白質，根據特征性譜帶的差異可鑒別該藥材的真偽。

同工酶電泳：為生物組織提取液電泳，酶活性染色后，可以看到酶譜帶。酶譜帶特征具有種特異性、發育階段特異性和組織特異性，具有簡潔、清晰等優點，但必須取新陳代謝活躍的部分，因此限制了其在干燥藥材鑒別上的應用。李桂蘭[24]用電泳鑒別菘藍過氧化物酶（POD）同工酶，其酶譜帶為其生長發育的調控研究和開發利用提供了參考依據。

毛細管電泳法：具有分離效率高、快速、無環境污染等優點。王磊磊等[25]用此法分析8種白芍樣品和7種赤芍樣品得出的指紋圖譜中白芍、赤芍共有峰的個數為15和10，可用于該藥材的質量控制。在毛細管區帶電泳、膠束電泳色譜法、非水相毛細管電泳、微膠乳電泳色譜法中，非水相毛細管電泳克服了水相中溶解度低的不足，并具有良好的選擇性，因而被認為是最好的技術[26]。

1.2.2 分子生物技術 應用廣泛的是DNA分子標記法。在DNA上檢測生物間的差異具有重復性好、靈敏度高等優點，可成為中藥品種鑒別可靠的依據和手段。主要有聚合酶鏈式反應（PCR）和隨機擴增多態DNA（RAPD）法等。曹暉等[27]用分子生物技術擴增蒲公英及混淆品的基因組DNA，根據DNA帶型差異可鑒別該藥材。中藥植物的rDNA序列如ITS1、ITS2、5.8S全長序列及18S、26S部分序列作為有效分子標記，電泳后獲得的特征圖譜可用來鑒別[28]。

1.2.3 生物芯片技術 將生命科學研究中所涉及的不連續分析過程，利用微電子、微機械、化學、物理、計算機技術在固體芯片表面構建的微流體分析單元和系統，使之連續化、集成化、微型化。主要有基因芯片、蛋白質芯片和芯片實驗室。

基因芯片：將許多特定的堿基片段固定于載體上，標記待測核酸，雜交后檢測雜交信號強度，計算機軟件綜合分析即可獲得樣品中大量基因序列特征。其前提是獲取不同中藥基因分型。蔡佩欣等[29]開發的DNA芯片為貝母種屬的驗證與質量控制提供了一種快速的檢測方法。隨著研究的深入，人們開始把目光投向于中藥活性成分的作用機制。謝守霞等[30]用基因芯片分析銀杏葉提取物對小鼠腎缺血再灌注損傷的保護作用機制。結果顯示，皮層內多種與腦功能相關的基因表達上調。該研究從基因水平提示其可能的作用機制，使得人們在基因水平上了解中藥的作用機制，給人們使用中藥安下一顆“定心丸”；也為中藥質量控制指標的確定提供了科學依據。

蛋白質芯片：將各種蛋白質固定于滴定板等載體上成為檢測用的芯片，用標記的成分與芯片作用，漂洗后采集各反應點的熒光強弱和熒光位置，經軟件分析圖像即可獲得有關的生物信息。王若光等[31]采用蛋白質芯片技術分析地龍生干品和炮制品，獲得蛋白質/肽成分的質量指紋圖譜分別含17和12個意義峰，可作為其數字化質控標準，并為進一步分離、純化及驗證地龍功能相關活性成分打下基礎。

芯片實驗室：不僅可以將同一個實驗的多個步驟集成到一步完成，還能將多種實驗集成到一張小小的芯片上。是將樣品制備、生化反應及檢測等過程集約化形成的微型分析系統。但由于技術上的難題，其應用還存在相當大的困難，因而目前關于用芯片實驗室鑒定中藥材的報道很少。但可以認為芯片實驗室是生物芯片發展的趨勢。

2 展望

隨著人類對中藥需求量的擴大，以及人類用藥安全意識的加強，中藥質量控制已顯得格外重要。中藥指紋圖譜作為一種有效的質量控制模式，以其科學的理論依據獲得國際上的一致認可。HPLC法是目前中藥質量控制的主要手段。多種儀器聯用以獲得多維信息也是目前的主流。然而，其控制的指標還處于發展完善中，還有待對各類中藥的藥理、藥效、藥動及生物等效性的相關性的深入研究。值得注意的是，通過從受體角度和中藥生物效應入手，建立中藥生物效應鑒定法來實現對中藥質量的控制，也是目前研究的熱點和有望成為中藥質量標準化控制的重要途徑。

而用生物指紋技術如rDNA特征序列標記法、生物芯片等獲得的生物指紋圖譜，對藥材種類的鑒別具有高通量、大規模等特有的優勢，但若僅僅是關于中藥的生物性，雖說有上述優點，但其不足之處就是未能鑒別中藥材的“道地”性，因為道地藥材質量高、藥效好的根本原因是其生物性與環境因子綜合作用的結果。因此，將生物指紋技術配合主要藥效成分的測定用于中藥質量的控制是目前較為合理的方法。另一方面，生物芯片技術能夠從基因水平上解釋中藥的作用機制，即用基因芯片分析中藥對基因的作用，用蛋白質芯片分析藥物對基因的表達情況，因此生物芯片技術對中藥藥效成分的確定及作用機制的研究具有重要的意義，也將促進中藥質量控制指標的發展和完善。

[1] 周玉新主編.中藥指紋圖譜研究技術[M].第1版.北京：化學工業出版社，2002：3-8.

[2] 邢旺興，宓鶴鳴，程榮珍，等.中藥紅曲的紫外光譜法鑒別[J].解放軍藥學學報，2000，16（3）：133.

[3] 成則豐，徐 銳，程存歸.傅里葉自解卷積-紅外光譜分析法應用于中藥天麻的鑒別研究[J].光譜學與光譜分析，2007，27（9）：1719.

[4] Liu HX，Sun SQ，Lv GH，et al.Discrimination of extracted lipophilic constituents of angelica with multi-steps infrared macro-fingerprint method[J].Vib Spectrosc，2006，40（2）：202.

[5] 趙龍蓮，張錄達，李軍會，等.小波包熵和Fisher判別在近紅外光譜法鑒別中藥大黃真偽中的應用[J].光譜學與光譜分析，2008，28（4）：817.

[6] 周 婧，都曉偉，馬宏躍，等.西洋參藥材高效液相色譜法指紋圖譜的研究[J].時珍國醫國藥，2006，17（12）：2381.

[7] 黎俊華，孔 偉.薄層色譜法定性鑒別溶栓丸中4味中藥[J].中國藥房，2006，17（10）：771.

[8] 康 純，聞莉毓，丁仲伯.微乳薄層色譜用于黃酮類成分分離鑒定的研究[J].藥物分析雜志，2000，20（2）：121.

[9] 鄭宵蓓，陳科力，尹文仲，等.鄂西高產半夏甾醇類成分的GC特征指紋圖譜研究[J].中國藥房，2009，20（3）：194.

[10] Qiu YQ，Lu X，Pang T，et al.Study of traditional Chinese medicine volatile oils from different geographical origins by comprehensive two-dimensional gas chromatographytime-of-flight mass spectrometry（GC×GC-TOFMS）in combination with multivariate analysis[J].J Pharm Biomed Anal，2007，43（5）：1721.

[11] Adahchour M，Beens J，Beinkman UAT.Recent developments in the application of comprehensive two-dimensional gas chromatography[J].J Chromatogr A，2008，1186（1-2）：67.

[12] 李云華，李修祿.用超臨界流體色譜（SFC）法作中藥及中成藥的鑒別[J].藥物分析雜志，1995，15（A01）：335.

[13] OuYang XK，Jin MC，He CH.Preparative separation of four major alkaloids from medicinal plant of tripterygium wilfordii hook f using high-speed counter-current chromatography[J].Sep Purif Technol，2007，56（3）：319.

[14] Gu M，Zhang SF，Su ZG，et al.Fingerprinting of salvia miltiorrhiza bunge by non-aqueous capillary electrophoresis compared with high-speed counter-current chromatography[J].J Chromatogr A，2004，1057（1-2）：133.

[15] Lu HM，Liang YZ，Chen S.Identification and quality assessment of houttuynia cordata injection using GC-MS fingerprint：A standardization approach[J].J Ethnopharmacol，2006，105（3）：436.

[16] Ren MT，Che J，Song Y，et al.Identification and quantification of 32bioactive compounds in lonicera species by high performance liquid chromatography coupled with tine-of-flight mass spectrometry[J].J Pharm Biomed Anal，2008，48（5）：1351.

[17] Zhai HL，Hu FD，Huang XY，et al.The application of digital image recognition to the analysis of two-dimensional fingerprints[J].Ana Chim Acta，2010，657（2）：131.

[18] 時新剛，李淑娥，孫慶雷，等.北沙參的1HNMR指紋圖譜研究[J].山東科學，2009，22（3）：24.

[19] 劉小平，陳笑宇，宋 青，等.六味地黃丸的X-衍射指紋圖譜鑒定研究[J].中藥材，2005，28（3）：184.

[20] Yang JH，Hu EP，Guo LH，et al.Methodology of XRD second derivative fingerprint for traditional Chinese medicine[J].Nat Prod Res Dev，2006，18（3）：390.

[22] Morinaga O，Zhu S，Tanaka H，et al.Visual detection of saikosaponins by on-membrance immunoassay and estimation of traditional Chinese medicines containing bupleuri radix[J].Biochem Biophys Res Commun，2006，346（3）：687.

[23] 李桂蘭.苦杏仁及混偽品的可溶性蛋白質電泳鑒別[J].山西中醫學院學報，2006，7（1）：50.

[24] 李桂蘭.中藥菘藍過氧化物同工酶的測定[J].山西中醫學院學報，2006，7（4）：43.

[25] 王磊磊，陳軍輝，王 虹，等.赤芍與白芍藥材高效毛細管電泳指紋圖譜方法學研究[J].時珍國醫國藥，2008，19（10）：2341.

[26] Hansen SH，Sheribah ZA.Comparison of CZE，MEKC，MEEKC and non-aqueous capillary electrophoresis for the determination of impurities in bromazepa[J].J Pharm Biomed Anal，2005，39（1-2）：322.

[27] 曹 暉，畢培曦，邵鵬柱.香港市售蒲公英及其混淆品土公英的DNA指紋鑒別研究[J].中國中藥雜志，1997，22（4）：197.

[28] 趙國平，錢三旗，新關稔，等.傘形科常用中藥品種rDNA序列特征及其標記方法研究[J].中藥材，2006，11（29）：1148.

[29] 蔡佩欣，胡學善，黃文秀，等.DNA芯片技術用于貝母的基因分型和種類鑒別[J].藥學學報，2003，38（3）：185.

[30] 謝守霞，張萬帆，賈孟良，等.基因芯片分析銀杏葉提取物對小鼠腎缺血再灌注損傷的保護作用機制[J].中國醫院藥學雜志，2006，26（12）：1455.

[31] 王若光，李春梅，王陸穎，等.以蛋白質芯片為中藥蛋白質/肽相互作用載體分析中藥地龍生干品和炮制品的生物學特征[J].中國組織工程研究與臨床康復，2008，12（13）：2489.

R282.5；R931.5

A

1001-0408（2011）19-1819-04

Δ國土資源部廣西壯族自治區巖溶動力學重點實驗室開放課題（kdl2008-14）

＊碩士研究生。研究方向：生物制藥。E-mail：l.w2009@163.com

#通訊作者：教授，碩士研究生導師，博士。研究方向：生物制藥工程。E-mail：jiangshiyun@126.com

2010-06-03

2011-03-12）

·醫藥政策·