銀杏葉提取物對慢性阻塞性肺疾病模型大鼠ET-1、TGF-β1的影響

劉 忠（遼寧醫學院附屬第一醫院呼吸內科，錦州市 121001）

慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary disease，COPD）的患病率和死亡率不僅在我國而且在全球范圍內均呈上升趨勢。其中肺動脈高壓是COPD最常見的并發癥，也是臨床防治的難點之一，其發病機制與低氧、炎癥、內皮損傷等多種因素有關。近年來，銀杏葉提取物（Ginkgo biloba extract，EGb）已應用于呼吸系統疾病的治療，取得了一定的療效，EGb可以在一定程度上減輕氣道的炎癥和改善氣道的重構[1]。本研究選擇熏吸香煙加氣管內注射脂多糖（Lipopolysaccharicle，LPS）法[2]復制COPD大鼠模型，應用光鏡、電鏡觀察COPD模型大鼠肺組織形態學變化，并測定EGb治療前后大鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）中內皮素-1（ET-1）和轉化生長因子-β1（TGF-β1）水平變化、氣道炎癥細胞數量變化，以探討EGb對COPD模型大鼠氣道炎癥是否具有抑制作用，為臨床應用EGb治療COPD提供理論依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

800型離心沉淀機（上海手術器械十廠）；Ⅲ型超薄切片機（瑞典LKB公司）；JEM-1200EX型透射電子顯微鏡（日本電子公司）；BX40型光學顯微鏡（日本Olympus公司）；CIAS-1000型細胞圖象分析系統（北京大恒圖象視覺有限公司）；7170A型全自動生化分析儀（日本日立公司）。

1.2 試藥

香煙為烤煙型無濾嘴大前門牌（上海卷煙廠，焦油量：15 mg，煙氣煙堿量：1.1 mg）；LPS（美國Sigma公司）；酶聯免疫（ELISA）試劑盒和放射免疫試劑盒（天津九鼎醫學生物工程有限公司）；EGb（北京雙鶴高科天然藥物有限責任公司，批號：20100712）。

1.3 動物

健康SD大鼠48只，鼠齡4～8周，體重（210±20）g，♀♂兼用，由遼寧醫學院實驗動物中心提供（動物生產合格證號：SCXK（遼）2003-2007）。

2 方法

2.1 復制模型和分組、給藥

實驗分為3組，即正常對照（將大鼠于第1、14天氣管內注入0.9%生理鹽水0.2 mL，第8天起每天ig 0.9%生理鹽水0.05 mL·kg-1）、COPD模型[將大鼠于第1、14天氣管內注入LPS 200 μL（1 μg·μL-1），第2～13、5～28天在自制吸煙染毒箱（70 cm×50 cm×50 cm，右上方帶有1.5 cm×1.5 cm通氣孔）內熏香煙2次/d，吸煙量為14支/次，其中每次吸煙時間1 h，2次間隔為1 h；第8天起每天ig 0.9%生理鹽水0.05 mL·kg-1，至第28天處死]和EGb（氣管內注入LPS和熏香煙過程同COPD模型組，第8天起每天ig EGb 200 mg·kg-1，至第28天處死）組。

2.2 BALF的采集

將大鼠用2%的戊巴比妥（25 mg·kg-1）麻醉后仰臥固定于操作臺，切開胸部，暴露出氣管和雙肺，結扎右主支氣管，在隆突上用套管針穿刺至左肺，緩慢注入無菌生理鹽水3 mL，每次注入后立即回吸得到BALF，重復3次。灌洗液以紗布過濾，回收率為60%～70%。吸取1 mL BALF置于血細胞計數器上，計數白細胞總數和分類。余BALF于4℃、1 500 r·min-1離心10 min，取其上清液置入離心管，－20℃貯藏，備用。

2.3 ET-1、TGF-β1的檢測

應用ET-1、TGF-β1檢測試劑盒，按說明書用放射免疫法檢測BALF中ET-1水平，用ELISA法測定BALF中TGF-β1的濃度。

2.4 病理標本制備和形態定量分析

取每只大鼠的隆突上2～3 mm處的氣管和中葉肺組織5 mm3，10%福爾馬林固定，酒精梯度脫水，浸蠟，包埋，切片，HE染色，光鏡觀察。將經過4%戊二醛固定的1 mm3右肺組織漂洗，用2%四氧化鋨固定，丙酮梯度脫水，包埋，聚合；切片，醋酸鈾-枸櫞酸鉛電子染色，透射電鏡觀察。每張切片均選取上、中、下、左和右5個視野，用高清晰度彩色病理圖文報告分析軟件對HE染色標本分別測量下列指標，測量時避開支氣管和大、中血管：（1）肺平均內襯間隔（Mean lung internal lining interval，MLI）：在高清晰度彩色病理圖文報告分析軟件上，以視野正中為中心劃“＋”字交叉線，計數通過該交叉線的肺泡間隔數（NS），測出“＋”字線的總長度（L）為2.552×10-3m，以MLI＝L/NS得到MLI，其數值反映肺泡平均直徑。（2）平均肺泡數（Mean alveoli numbers，MAN）：計數每個視野內的肺泡數（Na），測出每個視野的面積（S）為0.39×10-6m2，以MAN＝Na/S計算各個視野的MAN，其數值反映肺泡密度。

2.5 統計學方法

3 結果

3.1 光鏡觀察

正常對照組大鼠肺組織氣道黏膜上皮結構完整，纖毛排列整齊，管壁規整未見增厚，支氣管黏膜下未見明顯炎細胞浸潤，管腔內未見滲出物，肺泡結構連續，肺泡壁完整，肺泡腔未見病理性擴大，肺間質血管未見充血；COPD模型組大鼠小支氣管部分上皮脫落，支氣管腔內可見黏液栓和大量炎細胞，管壁及其周圍有明顯炎細胞浸潤，呼吸性細支氣管破壞，管腔部分閉塞，肺泡壁變薄甚至破裂，肺泡腔不規則擴大，有的肺泡相互融合成肺大泡，肺小動脈平滑肌細胞增生；EGb組大鼠肺組織炎細胞浸潤減少，支氣管黏膜上皮纖毛脫落及肺泡壁變薄、斷裂等損傷現象均較COPD模型組明顯減輕。大鼠肺組織光鏡下形態見圖1。

3.2 電鏡觀察

圖1 大鼠肺組織光鏡下形態（HE染色，40×）A.正常對照組；B.COPD模型組；C.EGb組Fig 1 Pulmonary morphology of rats in each group under light microscope（HE staining，40×）A.normal control group；B.COPD model group；C.EGb group

正常對照組大鼠氣道、支氣管黏膜上皮細胞纖毛排列整齊，無脫落，肺泡上皮細胞器結構正常，肺氣血屏障結構完整，毛細血管內皮細胞無腫脹及空泡樣變；COPD模型組大鼠Ⅰ型肺泡上皮細胞腫脹和脫落，杯狀細胞分泌增加，Ⅱ型肺泡上皮細胞增生，板層小體排空，線粒體腫脹，呈空泡樣變，內質網擴張，核固縮，表面纖毛減少脫落，肺泡腔內的巨噬細胞溶酶體增多；EGb組大鼠Ⅰ型肺泡上皮細胞腫脹、脫落和Ⅱ型肺泡上皮細胞線粒體腫脹、板層小體排空等損傷有所改善。大鼠肺組織電鏡下形態見圖2。

圖2 大鼠肺組織電鏡下形態（10 000×）A.正常對照組；B.COPD模型組；C.EGb組Fig 2 Pulmonary morphology of rats in each group under electron microscope（10 000×）A.normal control group；B.COPD model group；C.EGb group

3.3 肺組織形態學定量分析

與正常對照組比較，COPD模型組MLI顯著升高，MAN顯著降低（P＜0.01）；與COPD模型組比較，EGb組MLI顯著降低，MAN顯著升高（P＜0.05）。大鼠肺組織形態學定量分析結果見表1。

表1 大鼠肺組織形態學定量分析結果（±s，n＝16）Tab 1 Result of morphologic quatitative analysis of lung tissue in rat（s±s，n＝16）

表1 大鼠肺組織形態學定量分析結果（±s，n＝16）Tab 1 Result of morphologic quatitative analysis of lung tissue in rat（s±s，n＝16）

與正常對照組比較：＊P＜0.01；與COPD模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.COPD model group：#P＜0.05

MAN/（×106個/m2）405.33±25.46 283.20±17.81＊313.59±24.28#組別正常對照組COPD模型組EGb組MLI/（×106個/m2）51.24±8.37 91.67±16.81＊77.96±9.81#

3.4 BALF細胞計數、分類計數和ET-1、TGF-β1水平的變化

與正常對照組比較，COPD模型組BALF中白細胞總數和中性粒細胞（PMN）數顯著增加（P＜0.01），ET-1、TGF-β1濃度顯著升高（P＜0.01）；與COPD模型組比較，EGb組BALF中白細胞總數和PMN數顯著下降（P＜0.05），ET-1、TGF-β1濃度顯著降低（P＜0.05）。大鼠BALF中細胞總數、分類計數和ET-1、TGF-β1水平變化見表2。

表2 大鼠BALF中細胞總數、分類計數和ET-1、TGF-β1水平變化（±s，n＝16）Tab 2 Result of the level of ET-1 and TGF-β1，the total counts and differential counting of WBC in BALF of rat（s±s，n＝16）

表2 大鼠BALF中細胞總數、分類計數和ET-1、TGF-β1水平變化（±s，n＝16）Tab 2 Result of the level of ET-1 and TGF-β1，the total counts and differential counting of WBC in BALF of rat（s±s，n＝16）

與正常對照組比較：＊P＜0.01；與COPD模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.COPD model group：#P＜0.05

組別正常對照組COPD模型組EGb組TGF-β1/μg·L-1 1.62±0.46 5.66±0.35＊3.25±0.69#細胞總數/（×108個/L）1.73±0.83 6.50±0.72＊3.21±0.89#PMN數/（×108個/L）0.113±0.041 1.570±0.360＊0.543±0.213#PMN/%6.09±2.95 24.95±5.99＊17.19±5.49#ET-1/ng·L-1 66.7±10.55 129.33±12.67＊104.69±10.82#

4 討論

COPD是一組氣流受限為特征的肺部疾病，氣流受限不完全可逆，呈進行性發展，但可預防和治療[3]。其發病機制尚未完全明了，目前普遍認為，COPD以氣道、肺實質和肺血管的慢性炎癥為特征，這種慢性氣道炎癥是由非常復雜的相互作用的細胞因子構成的網絡調控的[4]。

本研究通過熏吸香煙加氣管內注射LPS法復制COPD大鼠模型，結果顯示，COPD模型組大鼠的氣道、支氣管有明顯的慢性支氣管炎特征性病理改變，肺組織出現局限性肺氣腫，肺泡隔斷裂、融合，周圍纖維細胞增生。同時，圖像分析系統提示，COPD模型組MLI較正常對照組增高，而MAN較正常對照組降低，兩指標的差異顯著，說明模型復制成功。

本研究表明，COPD模型組大鼠BALF中ET-1、TGF-β1的濃度、白細胞總數和PMN數均較正常對照組顯著增高（P＜0.01），提示COPD的氣道炎癥與支氣管肺局部ET-1、TGF-β1的水平增高密切相關。ET-1是一種生物活性多肽，其在肺部有著廣泛的生物學效應，不僅有收縮氣管、支氣管和血管平滑肌以及促平滑肌細胞、成纖維細胞增生作用，而且還有促進腺體分泌、炎性介質釋放等多種作用。肺臟既是內皮素作用的靶器官，又是ET-1合成、分泌、代謝的主要場所。有研究表明，組織缺血、缺氧及酸中毒情況下，ET-l釋放增多，且機體對其反應性增強，同時促使血管內皮強烈收縮[5]。TGF-β1是一種多功能細胞因子，能夠誘導上皮細胞層破壞、氣道炎癥、平滑肌細胞增殖、杯狀細胞增生以及促進血管重構等多種細胞反應[6]。TGF-β1主要由嗜酸粒細胞分泌，成纖維細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等多種細胞均能分泌TGF-β1。在哮喘和COPD患者及急性、亞急性和慢性哮喘小鼠模型的上皮細胞和平滑肌細胞中均發現 TGF-β1的過度表達[7，8]。本文結果提示，COPD的氣道炎癥與支氣管肺局部ET-1、TGF-β1的濃度呈顯著正相關，可能ET-1釋放增多致血管內皮細胞產生缺血性壞死，從而使血管內皮細胞本身釋放TGF-β1增加，而TGF-β1能夠通過促使杯狀細胞增生，誘導釋放ET-1導致血管重塑，促進氣道平滑肌的增生肥大、遷移以及破壞上皮細胞層等多種途徑參與氣道重塑[9]。結果表明，ET-1、TGF-β1參與了COPD氣道炎癥反應和氣道結構的重塑。

EGb是從銀杏葉中提取的具有獨特藥理活性的化合物，主要化學成分有黃酮類、萜類、酚類等。研究報道，EGb具有清除自由基，改善血液流變學及保護血管內皮細胞，抗炎，阻止血小板、白細胞與內皮細胞的黏附等作用[10]。本研究利用EGb進行干預，以探討其對COPD可能的預防保護作用。結果顯示，EGb組大鼠病理學檢查提示肺組織損傷較COPD模型組減輕。形態定量分析結果表明，EGb組MLI較COPD模型組降低，MAN較COPD模型組升高（P＜0.05），說明EGb可以抑制肺泡融合等肺泡結構改變，對肺氣腫結構的改建起到了一定的防治、緩解作用。同時研究結果表明，EGb組大鼠BALF中ET-1、TGF-β1濃度與白細胞總數、PMN數較COPD模型組下降（P＜0.05），提示EGb還可以有效抑制腺泡內肺動脈血管壁炎細胞浸潤、血管壁平滑肌細胞增生，抑制肺血管和氣道結構的重塑。

由此可見，本研究中EGb對大鼠COPD氣道重塑和肺血管重塑均有明顯的抑制作用，筆者推測其作用機制可能與抑制氣道、肺組織、肺血管的炎癥反應有關，因為炎癥貫穿COPD的整個發生發展過程。鑒于EGb的藥理作用和COPD形成因素的復雜性，其確切的作用機制有待進一步深入研究。

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