淺談禽白血病的檢測方法

1 抗原檢測方法

1.1 ELISA方法 ELISA方法的特點是特異性、敏感性高,設備要求低,適合大批量的流行病學調查和生產凈化。Ignyatovic等在1982年報道用抗原捕獲ELISA的方法進行GSA p27抗原檢測。韓靜等用抗A LV-p27的多克隆抗體建立了雙抗體夾心ELISA 方法用于檢測 A、B、J亞群A LV[1]。

目前市場上已有用于檢測ALVp27抗原ELISA試劑盒出售。不同試劑盒之間敏感性存在差異,郭慧君等對3種ELISA抗原檢測試劑盒進行靈敏度比較,發現3者之間靈敏度差異顯著[2]。

在樣品選擇方面,有研究表明蛋清中內源性ALV的ELISA反應假陽性結果少,因此蛋清樣品被認為是ALV抗原ELISA檢測的理想材料。

1.2 IFA方法 IFA方法可對抗原進行細胞定位。但是該檢測方法有時會產生非特異性熒光,且僅限于實驗室檢測。1983年Spencer等就建立了針對GSA抗原的IF技術,用于自然感染ALV的產蛋母雞的病毒傳播和感染分布檢測[3]。

1.3 PCR方法

1.3.1 直接PCR 用PCR方法檢測A LV核酸,是判斷病毒能否復制的一種指標。中國農業大學徐鑌蕊等從病死雞的腫瘤和組織中提取DNA,用設計的 ALV-J 引物 H5/H7(H5:5′-GGATGAGGTGACTAAGAAAG-3′,H7:5′-CGAACCAAAGGTAACACACG-3′)進行 PCR擴增和序列測定,從分子水平上證實了蛋雞J亞群禽白血病的發生[4]。尹遜河等直接從山東省3個不同AA肉雞場的雞胚和1日齡雛雞的各組織器官提取DNA,根據喬彩霞等已經發表的針對 p27的引物序列上游 5′-CCCGTGGAAT TCATGTAG TGAT TAAG-3′和下游 5′-CATACTCGAGGGCTGGATAGCAGACTACAT-3′進行了PCR擴增及產物序列測定,結果表明,ALV陽性檢出率從高到低順序為弱雛＞死胚＞健康雛＞正常胚。在各臟器中以腎臟中的病毒含量最多[5]。

在樣本檢測方面,Irit Davidson等研究表明作為PCR檢測的 DNA提取樣本,雞的羽毛尖優于肝、脾等臟器[6]。

1.3.2 RT-PCR 與PCR方法相比,RT-PCR方法檢測時間長,檢測成本高。但是它能夠更準確檢測病毒的存在。而且有學者認為采用從感染細胞提取總RNA進行RT-PCR,比直接從前病毒DNA進行PCR更容易得到完整的GAG和 p27基因。Pham等研究表明,RT-PCR在檢測蛋清A LV方面比ELISA更加敏感,更易與進行 ALV亞型的區分[7]。Coffinet等報道了用于鑒定 ALV A、B、C、D、E各個亞型的RT-PCR引物序列,擴增片段長度在300bp以下[8-10]。

1.3.3 QRT-PCR QRT-PCR是近年來發展起來的一種新的檢測技術。與傳統PCR相比,具有快速、自動化程度高、靈敏度高的特點。Yongbaek Kim等建立了基于ALV-J的特異性引物H5/H7的QRT-PCR技術用于ALV-J的定量,研究結果表明,這種QCRT-PCR方法可以定量到25fg的病毒RNA[11]。2008年李佳桃等建立了基于ALV群特異性基因gag基因的QRT-PCR的方法,最低可檢測82個拷貝的病毒核酸,與普通PCR方法相比,靈敏度高出1000倍[12]。而林甦等針對A LV-J ENV基因gp85區的片段,建立的QRT-PCR方法,檢測下限為8650個拷貝[13]。

1.3.4 其他PCR技術巢式PCR敏感性高,但也因此最容易受污染。Hitoshi Hatai等建立了從干燥的羽毛干中提取RNA或DNA進行ALV鑒定的巢氏PCR技術[14]。多重PCR可以在一次試驗中檢測出不同的病原。周剛等建立了同時鑒別內、外源性ALV的多重PCR方法。該方法可鑒定所有亞群的A LV[15]。

1.4 ISH IS H可以利用特定核酸順序進行病毒RNA的精確定量定位。Arshad S S等利用建立的針對J亞型ALV GAG或EN V序列的ISH技術發現腔上囊是病毒復制和基因表達的首選器官[16]。Stedman N L等利用IS H技術對自然感染的雞群進行ALV-J的定位,發現心肌細胞、蒲金野氏纖維、腦垂體染色最深,病毒含量最高[17]。

1.5 病毒分離目前的方法有雞胚分離培養和細胞培養。該方法適用于ALV的流行病學調查和凈化。但該方法的檢測周期長,技術要求高,在臨床實踐中的應用和推廣存在一定難度。

2 抗體檢測方法

目前市場上已有ALV-AB、J亞型抗體的檢測試劑盒出售。揚州大學葉建強等利用ALV-J特異性單抗JE29,建立了通過檢測A LV-抗原-抗體免疫復合物來診斷ALV-J的ELISA方法。該 ELISA具有良好的ALV-J ENV抗原特異性[18]。

在檢測樣本方面,傳統的抗體檢測普遍采用血清作為檢測樣本。但是Garrido M F等發現接種ALV A亞群標準株 RAV-1的白來航雞中羽髓(1羽髓加800μL緩沖液稀釋)中抗體水平和1∶500血清中抗體水平相關性顯著[19],因此認為羽髓也是進行ALV抗體檢測的可選樣本。

ALV在雞體內的作用機理很復雜,雞體的排毒情況也在不斷變化之中,同時由于雞群個體差異的存在和檢測方法的局限性,使用單一一種方法進行白血病檢測,存在一定的疏漏。故在檢測時,如有可能,應根據檢測目的、雞群代次、檢測時期和樣本,采取2～3種方法同時進行檢測。

[1]韓靜,陳晨,曹紅,等.禽白血病病毒p27基因在原核細胞的表達及生物學特性的初步分析[J].病毒學報,2005,21(4):293-295.

[2]郭慧君,李中明,李宏梅,等.3種ELISA試劑盒檢測不同亞型外源性雞白血病病毒的比較[J].畜牧獸醫學報,2010,41(3):310-314.

[3]S pencer J L,Gilk a F,Gavo ra J S.Distribution of lym phoid leuk osis virus and p27 g rou p-specific antigen in tissu es from laying hens[J].Avian Dis,1984,28(2):358-373.

[4]王玉田,徐鑌蕊,高云玲.雞腫瘤病診斷技術研究進展[J].家禽科學,2008(10):45-47.

[5]尹遜河,孫睛,李同樹,等.應用PCR從AA肉種雞雞胚和1日齡雛雞體內檢測出CIAV和ALV-J[J].中國獸醫學報,2007,27(5):636-639.

[6]Irit Davidson,Rinat Borenshtain.T he feather tip s of commercial chickens are a favo rable source of DNA for the amplification of Marek′s disease viru s and avian leu kosis viru s,subg rou p J[J].Avian Path ology,2002,31(3):237-240.

[7]Mohammadi A,AsasiK,Masoudian M,etal.Detection ofavian leu kosis virus(A LV)in alb umen of Shiraz com mercial and locallayer flock s using ELISA and RT-PC R[J].Iranian Journ al of Veterinary Research,2008,9(3):245-249.

[8]C offin J M,Champion M,Chabot F.Nucleotide sequence relationships betw een the genomes of an end ogenous and an exogenous avian tumor virus[J].J Virol,1978,28:972-991.

[9]Dorner A J,Stoye J P,Coffin J M.Molecular basis of host range variation in avian retroviruses[J].J Virol,1985,53:32-39.

[10]Bova C A,Olsen J C,Sw an strom R.T he avian retrovirus en6 gene family:m olecu lar analy sis of h ost range and an tigenic variants[J].J Virol,1988,62:75-83.

[11]Yongb aek Kim,T om P Brow n.Development of quan titative competitive-reverse transcriptase-polymerase chain reaction for detection and quantitation of avian leukosis viru s subg rou p J[J].J Vet Diagn Invest,2004,16:191-196.

[12]李佳桃,崔寶玉,岳華,等.熒光定量 RT-PCR檢測禽白血病病毒方法的建立及應用[J].中國動物檢疫,2008,25(9):25-28.

[13]林甦,朱春華,陳珍,等.雞 J亞型白血病病毒熒光定量 RTPCR檢測方法的建立[J].福建農業學報,2010,25(3):289-293.

[14]Hitoshi Hatai,Kenji Ochiai,Takashi Umemura.Detection of Avian leuk osis virus genome by a nested polym erase chain reaction u sing DNA an d RNA from d ried feather shafts[J].J Vet Diagn Invest,2009,21:519-522.

[15]周剛,牛成明,司昌德,等.內源和外源性禽白血病病毒鑒別PCR檢測方法的建立[J].中國預防獸醫學報,2010,32(7):546-549.

[16]Arsh ad S S,Smith L M,Howes K.Detection of avian leukosis virus su bgroup J(HPRS-103)u sing in situ hyb ridization[J].Avian Pathology,1998,27(1):91.

[17]Stedman N T,Brow n T R,Brow n C C.Localization of Avian Leukosis Virus Subgroup J in Natu rally Infected Chickens by RNA In Situ Hybridization[J].Vet Pathol,2001,38:649-656.

[18]葉建強,秦愛建,邵紅霞,等.J亞群禽白血病病毒(A LV-J)E LISA檢測方法的建立[J].中國獸醫學報,2006,26(3):235-237.

[19]Garrid o M F,S pencer J L,Chambers J R,etal.Feather pulp as a source of antibody to avian viruses[J].Avian Path ology,1992,21;333-337.