鈣蛋白酶系統與肉嫩度調控的研究進展

王廣銀

(1.德州學院農學系,山東 德州 253023;2.德州市兔業工程技術研究中心,山東 德州 253023）

肉嫩度是衡量肉質優劣的重要指標之一。近年來,人們試圖通過各種方法來改善肉質的嫩度,以滿足消費者的需求,但通過非遺傳因素來提高肉的嫩度成效不大[1],隨著分子生物技術的發展,標記輔助選擇為解決這一問題提供了新的思路。研究表明,鈣蛋白酶是影響宰后肉質嫩度最重要的候選基因,在肌肉纖維宰后嫩化中扮演著重要角色,控制著肌纖維蛋白的降解,是肌肉蛋白降解的限速步驟[2],因而在肉的嫩化中起著重要作用。本文簡要綜述鈣蛋白酶系統的結構、功能、活性調節及其在肉嫩化中的作用機理等研究進展。

1 鈣蛋白酶系統的結構和功能

鈣蛋白酶系統是高度可調的、復雜的蛋白質水解酶系統,主要包括依賴于Ca2+的鈣蛋白酶、鈣蛋白酶抑制蛋白和鈣蛋白酶激活蛋白,以及其活性表現為鈣非依賴性的骨骼肌特異性鈣蛋白酶。

1.1 鈣蛋白酶 鈣蛋白酶是細胞內鈣依賴性中性半胱氨酸內肽酶,主要存在于肌纖維Z盤附近和肌質網膜上。根據鈣蛋白酶表現半最高活性所需的Ca2+濃度的不同,可以將其分為鈣蛋白酶Ⅰ(μ-calpain）和鈣蛋白酶Ⅱ(m-calpain）[3],兩者都由2個亞基組成,其中30 kD小亞基在兩種鈣蛋白酶中是相同的,由DⅤ和DⅥ兩個結構域組成,兩結構域之間由一段富含脯氨酸的序列連接,為同一基因的產物,而80 kD大亞基是由4個結構域組成,是不同基因的產物[4]。大亞基的DⅠ在μ-calpain活化前或活化過程中自體水解發生自溶,是酶原活化時被加工的區域;DⅡ是表現水解活性的關鍵部位;DⅢ起活性調節作用;DⅣ是鈣離子的結合部位[5]。

在宰后肉類成熟過程中,μ-calpain通過降解α-肌動素、Z-nin蛋白,而m-calpain通過降解肌間線蛋白、聯結蛋白、半肌動蛋白、肌鈣蛋白 T和 I、原肌球蛋白、C-蛋白、M-蛋白來弱化肌纖維結構來提高肉的嫩度,但在成熟的過程中主要是μ-calpain,而不是m-calpain參與了肉的嫩化[6]。

1.2 鈣蛋白酶抑制蛋白 鈣蛋白酶抑制蛋白是細胞內專一性抑制鈣蛋白酶活性的蛋白質,它可以識別鈣蛋白酶與Ca2+結合引起的構象變化并與之特異性結合。鈣蛋白酶抑制蛋白含有5個結構域,N端第一個結構域稱L結構域,其功能目前還不太清楚,第2個到第5個結構域是4個相似的重復單位,每個重復單位含有A、B、C 3個保守區。鈣蛋白酶抑制蛋白主要是防止鈣蛋白酶被過度激活產生一種潛在而劇烈的破壞物,它調控著鈣蛋白酶的活性,是通過抑制鈣蛋白酶的自溶而發揮作用[7]。

1.3 鈣蛋白酶激活蛋白 鈣蛋白酶激活蛋白是鈣蛋白酶活性的直接調節者,它可以增強鈣蛋白酶在生理條件下對Ca2+的親和性,并與鈣蛋白酶結合而起活化作用,促進鈣蛋白酶活性的發揮[8]。目前發現的鈣蛋白酶激活蛋白有 UK 114和ACBP(酰基輔酶A結合蛋白）兩種,前者是μ-calpain的激活因子,后者是m-calpain的激活因子。UK 114分子量為30 kD的二聚體,ACBP分子量約為20 kD的二聚體,兩者氨基酸序列基本相同[9]。UK 114和ACBP的具體結構尚未見報道。

1.4 骨骼肌特異性鈣蛋白酶(p94） p94又稱CAPNⅢ,是最典型的組織特異性鈣蛋白酶。p94在構造上與μ-calpain和m-calpain的大亞基保持高度同源性,但又具有許多自身獨特性質,如p94不含小亞基、不形成異源二聚體、活性為鈣非依賴性等。p94的基因中存在3個獨特的插入序列,即NS、IS1及IS2,認為與其自我消化、酶壽命及與肌聯蛋白結合等有關[5]。目前盡管還沒有試驗證明它能水解肌原纖維中任何一種蛋白,但種種跡象表明,p94與肌纖維代謝活性及宰后嫩度密切相關[10]。

2 鈣蛋白酶活性調節

細胞中的鈣蛋白酶活性受到Ca2+、鈣蛋白酶抑制蛋白和鈣蛋白酶激活蛋白的調節,Ca2+、鈣蛋白酶激活蛋白是正調節因子,鈣蛋白酶抑制蛋白呈抑制性作用,鈣蛋白酶的活性表現是它們共同作用的結果。

2.1 Ca2+的調節作用 當鈣蛋白酶的大小亞基相結合時,它不具有活性,在被Ca2+激活后其大小亞基分離,大亞基主要起催化作用,小亞基主要起調節作用[11]。鈣蛋白酶表現蛋白水解活性,其具體過程為:大小亞基的分離、小亞基的自溶、30 kD亞基迅速降解為17 kD、大亞基自溶、80 kD轉化成78 kD再變成76 kD、鈣蛋白酶構象發生變化呈自溶狀態表現蛋白水解酶活性。除Ca2+濃度調控外,鈣蛋白酶的活性還受離子強度、pH值、底物等因素的影響[12]。

2.2 鈣蛋白酶抑制蛋白的調節機制 鈣蛋白酶抑制蛋白是一種內源性、需Ca2+激活的鈣蛋白酶抑制劑,在大多數組織中其濃度足以抑制鈣蛋白酶的活性[13]。當鈣蛋白酶被Ca2+激活后,如果附近有鈣蛋白酶抑制蛋白存在,將迅速與之結合而抑制鈣蛋白酶的活性,從而保證鈣蛋白酶對底物只進行局部特定位點的水解,起到防止鈣蛋白酶被隨機和過度激活的作用,鈣蛋白酶抑制蛋白和鈣蛋白酶的這種結合是可逆的,Ca2+濃度不足時兩者會發生分離。鈣蛋白酶抑制蛋白抑制鈣蛋白酶的大致過程為:鈣蛋白酶抑制蛋白的第Ⅱ到第V結構域中的A和C保守區,與鈣蛋白酶的Ⅳ和Ⅵ結構域緊密結合,然后B保守區與鈣蛋白酶的Ⅱ結構域結合而發揮作用[14]。

2.3 鈣蛋白酶激活蛋白的調節 鈣蛋白酶激活蛋白是鈣蛋白酶最直接的調節者,它可明顯提高鈣蛋白酶的活性,降低其激活所需的Ca2+濃度,使鈣蛋白酶抑制蛋白的抑制作用減弱,提高鈣蛋白酶對膜的吸附性。當鈣蛋白酶激活蛋白發揮激活作用時,首先鈣蛋白酶與鈣離子直接結合,然后鈣蛋白酶激活蛋白激活二者的復合體而不與鈣離子直接結合,其激活過程為:鈣蛋白酶激活蛋白與鈣蛋白酶80 kD的催化亞基結合,并促進其與小亞基的解離,使80 kD的亞基變為78 kD,隨后再變為75 kD,這樣就使鈣蛋白酶的活性大約提高100倍。鈣蛋白酶激活蛋白還與鈣蛋白酶抑制蛋白通過競爭性地爭奪結合位點實現對鈣蛋白酶的調控作用[9]。

3 鈣蛋白酶與肉的嫩化

肉的嫩化是動物宰后的一定時間內,肌纖維碎裂,肌肉變軟,嫩度增加的成熟過程。影響肌肉嫩度的因素很多,包括肌節的長度、肌內脂肪與結締組織的含量、肌肉結構蛋白水解敏感性、pH值等[13]。大量研究表明,鈣蛋白酶引起肌肉中蛋白質的水解,是導致宰后肌肉嫩化的主要原因。鈣蛋白酶引發肌原纖維蛋白降解的可能機制是:鈣蛋白酶被激活后,首先攻擊肌原纖維的肌節,或攻擊粗肌絲和細肌絲的連接處N2線,降解連接蛋白和半肌動蛋白,使肌原纖維I帶和Z盤結合變弱或斷裂,使肌纖維釋放出粗肌絲和細肌絲,細肌絲的肌原蛋白和原肌球蛋白及粗肌絲的C-蛋白進一步降解,分別解離出肌球蛋白和肌動蛋白,然后被溶酶體或胞質蛋白酶所捕獲進一步降解,導致肌原纖維的有序結構被破壞,從而有利于肉的嫩化[15]。

4 前景與展望

目前國內外關于鈣蛋白酶系統的研究主要集中在其基因cDNA序列分析與克隆、部分內含子的酶切及其與肉嫩度相關性的初步研究等方面,鈣蛋白酶系統的詳細結構、生理功能及具體調控機理還不是很清楚。隨著分子生物技術的發展和研究的不斷深入,在完善鈣蛋白酶系統的同時,一定會從中篩選出理想的肉質嫩度分子標記,從根本上加快遺傳進展,以獲得足夠嫩度高且穩定性好的肉產品,滿足廣大消費者的需求。

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