蛋白質分子量測試方法概述

譚和平，王彧婕，鄒 燕，譚福元，徐文平

（中國測試技術研究院，四川 成都 610021）

0 引 言

隨著后基因組時代的到來，生命科學進入了蓬勃發展的新階段，蛋白質及其結構、功能、活性、蛋白質組學等的研究發展非常迅速。作為蛋白質主要特征參數之一的分子量，是確定一種新型蛋白、進行蛋白質的后續研究活動的重要前提。因此，研究蛋白質的分子量測試方法，準確有效地對蛋白質的分子量進行測定，是十分緊迫的工作。

蛋白質分子量的測試方法有很多，有應用最廣泛和成熟的凝膠電泳法，以及凝膠色譜法、鹽析沉淀法、激光光散射法，特別是近年來技術日益成熟、發展迅速的生物質譜技術（包括電噴霧離子化質譜技術以及基質輔助激光解吸電離質譜技術）等，已成為生命科學領域不可或缺的工具。該文將對凝膠電泳法、高效凝膠過濾色譜-激光光散射聯用以及生物質譜技術進行簡要的介紹。

1 凝膠電泳法

凝膠電泳是根據分子物理性質（如電荷、大小、形狀）的不同而實現分離的一類分析技術，它分為聚丙烯酰胺凝膠電泳法、毛細管凝膠電泳法、瓊脂糖凝膠電泳法等。聚丙烯酰胺凝膠電泳法（PAGE）是蛋白質分子量測試中應用最廣泛的一類傳統方法，蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，它的遷移取決于它所帶電荷及分子大小和形狀等因素。在聚丙烯酰胺系統中加入十二烷基硫酸鈉（SDS）作為變性劑和助溶劑，大多數蛋白質能與SDS按一定比例結合，形成帶相同密度負電荷的復合物。它的量大大超過了蛋白質分子原有的電荷量，因而消除了蛋白質原有的電荷差別，使蛋白質分子電泳的遷移率主要取決于本身的分子量，而與蛋白質所帶的電荷無關。因此，可根據電泳遷移率求得其相對分子量。Cohen等[1]采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離和測試蛋白質和多肽的分子量。在該研究中，肌紅蛋白碎片和蛋白質標準物質混合物被證明能夠通過20 cm長、有40000個理論塔板的分離柱進行有效快速的分離，從而得到其相對分子量。

SDS-PAGE法對蛋白質樣品的需求量大，染色費時，操作過程較為繁瑣且重現性較差。此外，在測試蛋白質分子量的過程中，要特別注意溶液中SDS單體的濃度，保證SDS同蛋白質的比例在一個恰當的數值，才能夠使得蛋白質分子同SDS單體充分結合，以消除蛋白質分子原有的電荷差別；否則，最后得到的蛋白質分子量就會有較大的誤差。因此，該技術在分子量測試方面已被其他先進技術所取代。

2 高效凝膠過濾色譜-多角度激光光散射技術

凝膠色譜法是根據溶劑分子尺寸的不同進行分離的一種液相色譜法，利用高分子溶液通過填充有多孔的特種凝膠離子的柱子，把分子按從大到小的順序流出進行分離。它是一種設備簡單、操作方便的分離分析技術，對高分子物質有很好的分離效果。高效凝膠過濾色譜作為一種分離技術，常同多角度激光光散射儀等絕對質量分析器聯用測試蛋白質分子量。Ye等[2]采用高效凝膠過濾色譜-激光光散射法同時測定蛋白質的聚集、降解以及絕對分子質量。實驗中對蛋白質及其聚合體采用高效凝膠過濾色譜分離，多角度激光光散射檢測器進行測試，實驗研究的方法可以一次進樣后同時對蛋白質分子進行定量和分子量測定。丁厚強等[3]采用多角度激光光散射儀與凝膠色譜聯用測定了透明質酸鈉（HA）相對分子質量及其分布。

高效凝膠過濾色譜-多角度激光光散射技術分離測試蛋白質分子量的缺點在于對分子形狀的要求較高，需要標準蛋白與待測蛋白的分子形狀一致，測定結果才較為準確。因此，在不清楚待測蛋白分子形狀的情況下，測試誤差較大，應用有很大的局限性。

3 生物質譜技術

1906年，Thomson發明了質譜技術，最初只是用于無機化學中的同位素分析，直至20世紀40年代末才發展成為有機質譜。近年來，生物質譜技術取得了突飛猛進的發展，其中以電噴霧離子化質譜技術（ESI-MS）和基質輔助激光解吸電離質譜技術（MALDI-MS）的貢獻最為突出。這兩項技術的出現，使得生物大分子電離產生氣相離子成為可能，傳統的用于小分子研究的質譜技術發生了革命性變革，它能夠準確分析分子量從幾萬到幾十萬的生物大分子。同時，質譜在生物大分子的測定中還具有快速、準確、靈敏等優點，也使得質譜技術在生命科學領域得到長足發展。

3.1 電噴霧離子化質譜技術

電噴霧離子化質譜技術（ESI-MS）是在毛細管的出口處施加一高電壓，所產生的高電場使從毛細管流出的液體霧化成細小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發，液滴表面的電荷強度逐漸增大，最后液滴崩解為大量帶一個或多個電荷的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進入氣相的質譜技術。

1984年美國耶魯大學教授Fenn J B首次發表了電噴霧技術在質譜檢測中的應用，并隨后報道了運用ESI-MS進行蛋白質分析的科學研究[4]。Fenn的研究成果揭開了ESI-MS用于生物大分子研究的序幕，并推動了溶液體系中多肽與蛋白質分析的巨大發展。Fenn J B也因此獲得了2002年諾貝爾化學獎。

ESI-MS測定蛋白質大分子是根據一簇多電荷的質譜峰群，通過解卷積的方式計算得到蛋白質的分子量，由于ESI-MS可以產生多電荷峰，因此使得測試的分子質量范圍大大擴大。Green等[5]采用ESI-MS對質量差別很小的蛋白質分子量進行了區分和測定，顯示了質譜技術在蛋白質分子量測試上的優勢?？滓愕萚6]采用聚丙烯酰胺凝膠電泳、高效凝膠過濾色譜以及電噴霧離子化質譜3種方法對新發現的一種蛋白質的分子量進行了測定。結果表明，電噴霧離子化質譜同理論分子量最為接近，是目前測試蛋白質分子量最準確的方法之一。另外，研究表明，在溶液中加入改性劑可輔助蛋白質分子的離子化和去溶劑化，大大提高蛋白質分子測定的靈敏度。如根據蛋白質含有較多的堿性氨基酸的特點，在溶液中加入適當的酸性試劑，可以促進蛋白質分子的離子化。Sunia等[7]還討論了ESI-MS在測定蛋白質分子量過程中受pH值的影響情況，實驗表明流動相在較低的pH環境下，有利于正離子模式下含氮堿基化合物的離子化；流動相在較高的pH環境下，有利于負離子模式下含酸性基團的樣品的離子化。Voyksner[8]的研究表明甲醇、乙醇、異丙醇等具有較小表面張力的溶劑有利于ESI-MS實驗中含水溶劑的去溶劑化，同時可以稀釋緩沖鹽至質譜正常工作范圍內。隨著電噴霧電離技術的廣泛應用，它對多肽和蛋白質等的生物質譜分析已不僅僅局限于分子量的測試，而在近年來取得了長足的發展。通過HPLC-ESI-MS聯用儀分析酶解后的碎片，不需要任何純化便可用來檢測目標肽段[9]，進而確定蛋白質序列、確定和鑒別翻譯后修飾、測定蛋白質降解產物等重要工作；ESI-MS還可以分析肽的合成產物、研究非共價蛋白復合物以及對寡核苷酸進行測定等。

ESI-MS的優勢在于：（1）對樣品的消耗少，不會造成樣品的大量浪費；（2）對樣品分子質量測試靈敏度、分辨力和準確度都相當高；（3）能夠方便地與多種分離技術聯用，如毛細管電泳、高效液相色譜等，是解決非揮發性、熱不穩定性、極性強的復雜組分化合物的定性定量的高靈敏度檢測方法。

3.2 基質輔助激光解吸電離質譜技術

基質輔助激光解吸電離質譜技術（MALDI-MS）是將待測物懸浮或溶解在一個基體中[6]，基體與待測物形成混晶，當基體吸收激光的能量后，均勻傳遞給待測物，使待測物瞬間氣化并離子化?；w的作用在于保護待測物不會因過強的激光能量導致化合物被破壞。

1987年，日本Shimadzu公司工程師Koichi Tanaka利用基質輔助激光解吸方法成功測定了生物大分子，隨后德國科學家Karas M和Hillenkamp F利用有機基質（煙堿酸）成功測試了多種蛋白質和寡核苷酸，開啟了MALDI-MS在蛋白質組學應用領域的新篇章[7]。2002年諾貝爾化學獎同時也頒發給了Koichi Tanaka，以表彰他在生物大分子測量領域的卓越貢獻。季怡萍等[10]采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜法測定了鈣調蛋白的純度與分子量，并對所得的結果進行了討論，實驗結果表明該方法具有靈敏度高、分析速度快、重復性好、信息直觀等特點，是其他傳統測定蛋白質分子量的方法無法比擬的。Jeannot等[11]采用基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜對由十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質進行精確分子量測定。實驗對凝膠成分十二烷基硫酸鈉、甘油以及三羥甲基氨基甲烷緩沖液對質譜信號的影響進行了系統的研究，甘油及三羥甲基氨基甲烷緩沖液對質譜分辨力和準確度幾乎沒有影響，但即使是在低濃度情況下，十二烷基硫酸鈉也會使得質譜的靈敏度、分辨力和準確度降低。在樣品前處理中，采取了在凝膠中去除過多SDS的方法，減少了峰形過寬對蛋白質分子量精確測定的影響。此外，基質輔助激光解吸電離技術的發展，使MALDI-MS在蛋白質鑒定、蛋白質相對定量、蛋白翻譯后修飾位點鑒定和定量、生物標志物發現、核酸分析-序列確認等方面都有很好的應用。

MALDI-MS的優勢在于：（1）同ESI-MS一樣對樣品的消耗很少；（2）隨著質量分析器的不斷改進、新的基質的不斷發現和應用以及延遲萃取技術的使用，使得MALDI-MS的最高分辨率不斷提高，甚至超過 ESI-MS[4]；（3）MALDI-MS 單電荷峰占主要部分，碎片峰少，非常有利于對復雜混合物的分析，且能忍受較高濃度的鹽、緩沖劑和其他難揮發成分，降低了對樣品預處理的要求；（4）MALDI-TOF質譜對生物大分子分子量的測定范圍是所有測試技術中最廣的。

4 結束語

蛋白質分子量測試技術是蛋白質相關測量工作的基礎，隨著基因組計劃的快速、全方位的推進，蛋白質分子量測定的科學研究工作必將受到越來越廣泛的關注。ESI-MS和MALDI-MS是目前測定蛋白質分子量最先進的方法，兩者在樣品消耗量、測試靈敏度、分辨力和準確度上都達到很高的水平。ESI-MS的缺點在于對樣品純度要求高，且會形成多電荷的質譜峰群，難以分辨，使得結果分析較為困難。如，ESI-MS在分析糖蛋白時會產生大量的重疊峰[12]。相比于ESI-MS，MALDI-MS對樣品純度要求低，能夠測定純度不高的混合物，降低對樣品預處理的要求；并且對蛋白質分子量的測試范圍比ESI-MS更廣，是未來蛋白質等生物大分子分子量測定的主流工具。但是，MALDI-MS與高效液相色譜、毛細管電泳等分離設備的聯用，目前只能采取離線的方式，致使分析結果的重復性較差，與MALDI-MS本身高精密度的特性不匹配，如果能有效解決MALDI-MS與預分離技術的聯用問題，必將會使其在生命科學領域獲得更廣泛的應用，發揮更大的作用。

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