液相色譜－高分辨質譜在獸藥殘留分析中的應用進展

夏 曦，李曉薇，丁雙陽，沈建忠

（中國農業大學動物醫學院，國家獸藥殘留基準實驗室，北京 100193）

液相色譜－高分辨質譜在獸藥殘留分析中的應用進展

夏 曦，李曉薇，丁雙陽，沈建忠

（中國農業大學動物醫學院，國家獸藥殘留基準實驗室，北京 100193）

液相色譜－高分辨質譜（LC-HRMS）技術在獸藥殘留分析領域的研究已經顯示出巨大的發展潛力。本文闡述了LC-HRMS技術的特點，并總結了近幾年來LC-HRMS在獸藥多殘留篩選分析中的應用實例，展望了LC-HRMS技術的發展前景。應用高分辨質譜的全掃描和精確質量測定功能，結合超高效液相色譜技術，優化樣品前處理方法，可以實現100多種獸藥殘留的同時檢測。與四極桿質譜相比，高分辨質譜的參數設定簡單，并適用于非定向和未知化合物的篩選，需要增加目標化合物時，不必再次處理樣品和進樣，重新分析已有的全掃描數據即可。UHPLC-HRMS作為最有潛力的分析技術，仍有很大的發展空間，TOF的分辨率和Orbitrap的掃描速度有待提高，簡便易用的數據處理軟件也需要完善。

獸藥殘留；液相色譜；高分辨質譜

食品安全已經引起了全社會的廣泛關注，其中獸藥殘留是影響動物源性食品安全的主要因素之一。在畜牧養殖上，各種抗生素、激素等藥物不但被用于動物疾病的治療，同時還添加到動物日糧或飲水中用于非治療性的目的，主要表現為發病率及死亡率的下降、促生長、提高飼料轉化率、改善產品品質等效果。這些藥物的過量和違禁使用不可避免的產生了獸藥殘留。獸藥殘留的危害嚴重，會引起敏感人群的中毒反應，可能導致各種慢性、蓄積毒性，長期低劑量用藥還容易誘導細菌耐藥性的產生。因此，加強獸藥殘留監控已是刻不容緩的事情。

常用的獸藥有10多類，上百種，同時檢測多類獸藥是殘留分析工作者面臨的巨大挑戰。現階段，高通量的篩選結合準確的確證是廣泛采用的獸藥殘留檢測方法。酶聯免疫吸附試劑盒是最常用的篩選方法，一次能夠檢測至少幾十個樣品，操作相對簡單，其缺點是一種試劑盒只能針對一種藥物，而且無法避免假陽性。目前，色譜－質譜聯用是唯一有效的殘留檢測確證技術。單四極桿質譜、離子阱質譜和三重四極桿質譜運用選擇離子掃描（SIM）或多反應監測（MRM）掃描方式，具有極高的靈敏度和選擇性，氣相色譜－質譜（GC/MS）和 液 相 色 譜－三 重 四 極 桿 質 譜（LC-QqQ-MS）被廣泛用于確證檢測［1－4］。同時，LC-QqQ-MS也被用于已知化合物的篩選，但是當檢測多個目標化合物時，為了保證每個MRM通道的駐留時間，需要根據化合物的色譜保留時間分段設定參數，能夠同時檢測的化合物數量有一定的限制。如果要進行未知化合物的篩選，則需要全掃描模式采集數據，單位分辨的四極桿質譜在全掃描模式下的靈敏度很差，不能滿足殘留分析的要求。

與低分辨質譜不同，高分辨質譜（HRMS）（如飛 行 時 間 質 譜 （TOF-MS）、軌 道 阱 質 譜（Orbitrap-MS）等）能夠提供高質量準確度、高質量分辨率的全掃描數據。液相色譜與高分辨質譜聯用（LC-HRMS）能夠提取目標化合物的精確質量色譜圖，理論上可以分析的化合物沒有數量限制。如果需要增加新的目標化合物，HRMS的全掃描數據還可以隨時進行重新處理。儀器方法的設定也相對簡單，不會因為目標化合物的增加而損失靈敏度。在實際應用中，研究人員已經建立了能夠同時檢測上百種獸藥的方法，顯示了LC-HRMS法在獸藥殘留篩選方面的巨大潛力。本工作總結了近年來的研究結果，綜述了LC-HRMS的發展及其在獸藥殘留分析中的應用。

1 液相色譜－高分辨質譜的發展

液相色譜能夠用于分析幾乎所有的獸藥，但是如果要一次分析多種藥物，如進行多類化合物的篩選，色譜運行的時間會相對較長。液相色譜的分離度不如氣相色譜，需要優化梯度洗脫來獲得適當的分離，尤其是獸藥殘留需要檢測的動物組織樣品成分復雜，由色譜的共流出物引起的基質效應幾乎不可避免，分離度越好，越可以有效降低離子抑制效應。研究人員一直期望能夠同時提高液相色譜的分離度和分析速度。區別于傳統的高效液相色譜（HPLC），超高效液相色譜（UHPLC）的出現使人們看到了希望，其解決分離度和速度的途徑有以下幾種：1）提高柱溫以降低流動相的粘度和極性；2）用整體柱替代顆粒填充柱；3）使用小顆粒填料［5－7］。目前，應用最廣泛的是亞2μm顆粒填料技術，自問世以來已有600篇以上相關文獻的報道。總體來說，UHPLC可以保持在原有的或更好的分離度下，提高3～5倍分析速度，并增加峰容量［8－10］。

常見的高分辨質譜包括磁質譜、傅里葉變換離子回旋共振質譜（FTICR-MS）和 TOF-MS等，其中磁質譜和FT-MS的購買、運行和維護價格昂貴，操作繁瑣，分析速度較慢，不適合于獸藥殘留的常規檢測，因此不做詳述。TOF-MS能夠達到5ppm的質量精度和較快的采樣速度（10次/秒），被越來越多的應用于獸藥殘留的篩選分析。TOF-MS一直以來受人詬病的主要問題是動態范圍較小，影響精確質量的測定和定量結果的準確性。當化合物的濃度過高，檢測器由于信號溢出不能測定其精確質量，動態范圍增強（DRE）功能的出現能有效地解決這一問題。開啟DRE功能時，如果檢測到大量的某個離子，儀器會切換到低靈敏度的模式以測定其精確質量，并根據放大因子校正響應值。Leandro等［11］比較了是否應用DRE對精確質量測定的區別，測試的藥物濃度為1.0mg/L，如果關閉DRE，獲得的質譜圖顯示信號飽和，質量誤差為14mu，而應用DRE后，質量誤差小于1mu。隨著TOF-MS離子光學系統的優化，檢測器的設計運用了高速模擬數字轉化技術（ADC），使TOF-MS從根本上獲得了更寬的動態范圍，在同時檢測低濃度和高濃度化合物時更為精確。

LC-TOF-MS的精確質量測定在復雜樣品檢測中有很好的選擇性和靈敏度，同時也需要保證足夠的質譜分辨率，否則在篩選時容易出現假陰性［12］。文獻中的TOF-MS基本上都能達到5ppm的質量精度和最高15 000FWHM的分辨率，但在分析復雜基質樣品時仍會稍顯不足。Orbitrap-MS是一種結合靜電場離子阱和快速傅里葉變換技術的新型質譜，2000年首次報道［13］，并迅速得到商品化應用。Orbitrap臺式質譜擁有100 000FWHM的分辨率和2～5 ppm的質量精度，成功的把FT-MS小型化，在檢測獸藥殘留時可以降低復雜背景的干擾。但是，Orbitrap-MS的高分辨率會犧牲掃描速度，在與UHPLC聯用時遇到了瓶頸。UHPLC的峰寬一般為2～5s，因此質譜的速度至少需要達到5Hz，每個色譜峰才能采集到足夠的數據點，而Orbitrap-MS在此情況下的分辨率沒有優勢可言。不過Orbitrap-MS的發展很快，相信掃描速度更快的儀器不久將會問世。

2 液相色譜－高分辨質譜在獸藥殘留分析中的應用

多類藥物的篩選方法在農藥殘留檢測中早已得到廣泛應用［14－15］，而在獸藥殘留分析中才逐漸興起。不同種類的獸藥理化性質差別較大，同時分離純化多類藥物的前處理比較困難，檢測不同動物基質中獸藥殘留的方法也具有各自的特點。

2.1 尿液中獸藥殘留的檢測

很多藥物經腎臟排出體外，在尿液中的殘留量通常很高，文獻中已有大量檢測尿液中獸藥殘留方法的報道［16－19］。藥物在尿液中大多不是游離狀態，而且經常與內源性的小分子（如葡萄糖醛酸、硫酸等）形成軛合物，這為尿液中獸藥殘留的檢測增加了難度，需要進行較長時間的酶解反應后才能有效地提取藥物。活體動物的尿液采集非常困難，屠宰時動物受到驚嚇產生排尿反應，膀胱中剩余的尿液已很少，不論是方法學建立時空白對照尿液的來源，還是實際樣品的采集都不易解決。

Touber等［20］建立了牛尿中22種藥物的UHPLC-TOF-MS檢測方法，其中包括17種糖皮質激素、類固醇以及β－受體激動劑。以含0.1%甲酸的水和乙腈為流動相進行梯度洗脫，整個色譜運行時間為5.5min。UHPLC的分離效果很好，其中作為同分異構體的地塞米松和倍他米松都得到分離。TOF-MS的分辨率為10 000FWHM，每個化合物可以提取50mu質量精度的質量色譜圖，糖皮質激素的質量誤差在6ppm之內。牛尿中方法的檢出限（LOD）為0.1～3.3μg/L，定量限（LOQ）為0.4～4.4 μg/L。該方法可以很容易的擴展到別的違禁藥物，當添加另外21種β－受體激動劑時，對原有藥物的檢測沒有影響。

Kaufmann等［21］認為 UHPLC-TOF-MS是獸藥殘留篩選的新手段，并建立了檢測尿液中上百種獸藥的方法，包括喹諾酮類、磺胺類、硝基咪唑類、頭孢類、大環內酯類、苯并咪唑類、鎮靜劑類、四環素類以及孔雀石綠等藥物。尿樣經過稀釋后不用處理直接進樣，單次進樣的梯度洗脫總時間為7.5min，顯示了極高的樣品通量。該方法開發時使用的是常規5μm顆粒色譜柱的HPLC，進樣量為20μL，一般在分析120個樣品后，由于質譜接口受到基質的干擾靈敏度會降低。最終采用了1.7μm的UHPLC，進樣量減少為5μL，能有效的克服靈敏度下降的問題。90%以上藥物的LOQ都低于10μg/L，LOQ值最高的乙酰磺胺和洛硝噠唑為45μg/L。提取精確質量的色譜圖可以減少背景的干擾，但是如果提取色譜圖的窗口太窄，則會丟失目標化合物，因此精確質量的窗口應該根據儀器的分辨率來選擇。對于尿樣中藥物的確證，檢測到其代謝物是強有力的證據，但是一般這些代謝物難以獲得標準物質進行對照，而運用TOF-MS的精確質量測定和元素組成分析對代謝物的定性有很大幫助。

Stolker 等［22］同時運用LC-QqQ-MS 和LC-QTOF-MS檢測牛尿中的皮質激素，并對兩種技術的定性定量分析結果進行比較。研究中所用的三重四極桿和飛行時間質譜分別為Quattro Ultima和Ultima API，二者均能滿足獸藥殘留檢測的要求。其中LC-QTOF-MS在定性分析方面具有一定的優勢，一次進樣的質譜圖就可以定性；而LC-QqQ-MS有時則需要二次進樣，并且LC-QTOF-MS的精確質量測定能夠有效提高質量色譜圖的選擇性，排除干擾。在方法學的驗證方面（如線性范圍和重現性等），LC-QqQ-MS和 LC-QTOF-MS的性能相似，LC-QqQ-MS僅在靈敏度上比LC-QTOF-MS更好。

2.2 毛發中獸藥殘留的檢測

很多獸藥和激素在動物組織內的消除速度很快，為監控違禁添加物的濫用增加了難度。區別于肉、肝、腎等組織，毛發樣品可以活體采集，不會引起動物的死亡或疼痛，運輸和保存也較為容易。更為重要的是，很多藥物在毛發中殘留的含量高于肉、肝、腎等組織，消除趨勢也很緩慢［23－26］。在檢測同化激素、β－受體激動劑等藥物殘留時，選擇毛發作為檢測的靶組織值得推廣。但是，毛發樣品作為靶組織的問題在各個環節的質量控制有一定困難，難以確定目標化合物是否完全被提取出來，也不易區分陽性樣品確實是藥物殘留還是由毛發的外部污染造成的［27］。

Van der Heeft等［28］運用UHPLC-TOF-MS和UHPLC-Orbitrap-MS進行牛毛中激素殘留的全掃描精確質量測定，TOF和Orbitrap的型號分別為LCT Premier TOF MS和LTQ Orbitrap XL MS。空白對照的牛毛樣品經過清洗、干燥后，剪碎為1cm左右的小段，再進行粉碎。毛發經磷酸鹽緩沖液振蕩提取后，加入甲醇并離心。上清液加入純水稀釋，然后用Bond Elut固相萃取柱凈化，洗脫液干燥后用甲醇－乙腈－水溶液復溶，并添加14種類固醇。UHPLC-Orbitrap-MS在分辨率為60 000FWHM時，能夠檢測到全部的低濃度（ng/g）添加的藥物，并且質量誤差小于3ppm。對于毛發樣品的分析，質量誤差要小于5ppm，提取的質量色譜圖才能有效地排除基質本底的干擾。當UHPLC-TOF-MS的分辨率為10 000FWHM或者UHPLC-Orbitrap-MS的分辨率只有7 500FWHM時，就不能檢測到所有添加的化合物。為了降低檢測的假陰性率，在進行復雜樣品的精確質量測定時，必須保證質譜的高分辨率。

2.3 牛奶中獸藥殘留的檢測

牛奶的營養豐富，奶制品在人民的膳食結構中占有重要地位，牛奶中的獸藥殘留一直是監控的重點。集約化飼養的奶牛極易發生乳房炎等疾病，用藥不當或者沒有嚴格執行休藥期就會導致牛奶中的藥物殘留。Stolker等［29］建立了牛奶中101種化合物的定量篩選方法，覆蓋了苯并咪唑、大環內酯、β－內酰胺、喹諾酮、磺胺、吡啶、四環素、硝基咪唑、鎮靜劑、非甾體類抗炎藥、離子載體和氯霉素等12類藥物。樣品經乙腈提取和蛋白沉淀后，用Strata X固相萃取柱凈化，然后用UHPLC-TOF-MS測定。采集全掃描的數據，根據每個藥物的相對分子質量提取精確質量色譜圖進行定性定量分析。按照歐盟法規中對定量篩選方法的要求驗證方法學性能，在最高殘留限量的濃度水平，86%目標化合物的重復性低于20%，96%目標化合物的重現性低于40%，88%目標化合物的回收率在80%～120%之間，方法的靈敏度和線性范圍也符合定量方法的標準。該方法能夠準確的分辨疑似樣品和陰性樣品，判斷藥物含量是否超過最高殘留限量。在運用該方法進行實際樣品檢測時，分析了100份牛奶樣品，沒有發現陽性樣品，只是檢驗出了含有磺胺的質量控制樣品。

為了提高樣品的分析速度，Ortelli等［30］運用超濾離心技術簡化樣品前處理步驟，每天可以分析50個樣品。牛奶樣品加入乙腈沉淀蛋白，經17 000g離心后，吸出上清液轉移至3kD的超濾離心管中，再用17 000g離心60min，進一步清除提取溶液中的大分子物質。超濾后的提取液經濃縮蒸發乙腈，這樣就完成了樣品的制備。該方法能夠篩選150種常見的獸藥及其代謝物，LOD在0.5～25μg/L之間，遠低于大部分藥物的最高殘留限量。乙腈沉淀蛋白結合超濾離心的方法比固相萃取法要快很多，基質效應也嚴重一些，不過不同來源的牛奶樣品引起的基質效應基本一致，只有非班太爾和紅霉素受到的影響隨不同的樣品而變化較大。喹諾酮類藥物顯示了離子增強效應，其中恩諾沙星增強了1 300%。在進行實際樣品驗證時，所有的陰性樣品與ELISA的結果相同，而檢測到含有喹諾酮類藥物的疑似陽性樣品與ELISA有區別。

2.4 組織中獸藥殘留的檢測

Hermo等［31］應用LC-TOF-MS（型號：MSD Sciex MassHunter TOF MS）檢測豬肝中8種喹諾酮類藥物的多殘留方法，并在方法性能上與LC-Q-MS（LC-quadrupole-MS）和 LC-QqQ-MS（型號：PE Sciex API3000）進行比較。LC-TOF-MS方法的定量限能達到1.5～6 μg/kg，所有喹諾酮的回收率均在60%以上，檢測限低于2μg/kg，在靈敏度、線性范圍、準確度、精密度方面都能滿足獸藥殘留檢測的要求。LC-TOF-MS的靈敏度介于LC-Q-MS 和LC-QqQ-MS之間，其LOQ值比LC-Q-MS的低1～4倍，但比LC-QqQ-MS的高1.5～6倍。不論是LC-TOF-MS和LC-QqQ-MS方法，在繪制標準曲線時，個別目標化合物高濃度點（250～300μg/kg）的響應值會影響曲線的相關性。LC-TOF-MS較 LC-QqQ-MS的優點在于化合物精確質量的測定。當運用LC-QqQ-MS分析惡喹酸和氟甲喹時，這兩個化合物的準分子離子都是m/z262，有相同的碎片離子m/z244，色譜的保留時間也相同；而用LC-TOF-MS檢測時，分別提取m/z262.071 0和m/z262.087 4就能夠將二者區別開來。

同樣是應用LC-TOF-MS檢測喹諾酮類藥物的殘留，Zheng等［32］研究了固相微萃取技術純化牛奶、雞蛋、雞肉和魚肉中7種喹諾酮的方法。樣品提取后，經在線固相微萃取凈化并直接進行LC-TOF-MS分析。在雞蛋、牛奶、雞肉、魚肉中，7種喹諾酮的 LOD分別為0.3～1.2 μg/kg、0.2～3.0μg/L、0.2～0.7μg/kg、0.2～1.0μg/kg，標準曲線的相關系數都在0.995以上。在4種不同基質中，喹諾酮的回收率在80～115%之間，相對標準偏差小于14.5%。該方法結合內標和基質添加標準曲線進行定量分析，回收率較好，但是選擇氧氟沙星作為內標較為不妥，因為在實際樣品中可能有氧氟沙星的殘留而影響定量結果。

經反相液相色譜分離后，Carrasco-Pancorbo等［33］運用紫外和TOF-MS檢測蜂蜜中8種四環素。不同的藥物在正離子和負離子模式下靈敏度不一致，但是產生的主要碎片離子都是脫水和/或脫氨基形成的。在負離子模式下，8種四環素的LOD為0.05～0.76μg/kg，優于已有的報道，能夠分析的四環素藥物種類也最多。添加回收實驗的濃度為10～100μg/kg，回收率在72%～91%之間，相對標準偏差不超過7%。在LOQ濃度附近時，檢測到的四環素類藥物的質量偏差基本上在5ppm以下。該文指出，單獨依靠高精確質量（＜1ppm）難以有效確定化合物，結合同位素豐度比進行過濾，才能把幾千種可能的化合物減少為幾種候選化合物。

Hernando等［34］報道了檢測鮭魚中3種喹諾酮、紅霉素、孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠、埃瑪菌素的LC-TOF-MS方法。樣品前處理采用固液萃取的方法，回收率高于80%，恩諾沙星的回收率偏低，只有40%左右。在最高殘留限量濃度附近進行精密度測定時，批內和批間變異系數為2%～15%。方法的LOD為1～3 μg/kg，LOQ為3～9μg/kg，遠低于這些藥物的最高殘留限量，但是孔雀石綠和隱色孔雀石綠的LOQ分別為2μg/kg和1μg/kg，高于歐盟法規中最低要求執行限（MRPL）的標準（孔雀石綠和隱色孔雀石綠二者之和為2μg/kg）。該方法的線性范圍從LOQ到600μg/kg，相關系數大于0.999。TOF-MS能夠增強方法的選擇性，當提取質量色譜圖的質量窗口由0.2u變為0.01u時，可以把孔雀石綠的基質干擾消除。同時，目標化合物的信噪比也從31提高到120，但是繼續縮小質量范圍至0.001u時，靈敏度變化不大。

關于高通量的獸藥殘留前處理方法的文獻較少，分析動物組織比處理尿液和牛奶等液體樣品的難度更大，Kaufmann等［35］優化了肉、肝、腎等組織中100多種獸藥殘留的提取和純化方法。提取液為乙腈和Mcllvaine緩沖溶液，加入硫酸銨使乙腈和水相提取液分層。乙腈可以沉淀蛋白，提取的雜質較少，緩沖溶液能夠有效地提高極性化合物（如四環素類、青霉素類）的提取效率，并且有機相和水相分離有利于濃縮，降低乙腈在旋轉蒸發時引起的損失。提取液經Oasis HLB固相萃取柱進一步凈化，單獨使用乙腈洗脫時，一些極性很強的青霉素類藥物難以洗脫下來。該方法分兩步洗脫，先用乙腈洗脫下大部分的目標化合物，并使固相萃取柱上吸附的蛋白變性，然后再用乙腈緩沖液洗脫，提高極性化合物的回收率，效果很好。在樣品前處理的復溶、轉移等步驟中，使用二甲基亞砜可以提高非極性化合物的回收率。在用 UHPLC-TOF-MS測定時，Kaufmann等認為ADC和DRE等技術已經顯著改善了TOF-MS的動態范圍，而選擇性是TOF-MS的主要局限，在分析復雜樣品中低質量的化合物時問題尤為突出，需要注意儀器的分辨率和質量軸穩定性。該文同時提出，快速實用的數據處理軟件也有待開發，因為在分析每個樣品的數據時，必須提取上百種化合物的精確質量色譜圖并進行判斷，工作量很大。雖然TOFMS的分辨率達到12 000FWHM（LCT Premier TOF MS），在分析肝臟樣品時干擾很多，并且不能適用于蜂蜜樣品，因此考慮應用分辨率更高的Orbitrap-MS（Orbitrap Exactive HCD）代 替TOF-MS，卻發現Orbitrap-MS的離子抑制非常嚴重，有些化合物甚至檢測不到［36］。造成這種現象的原因是離子源后起離子聚焦作用的C-trap捕捉到大量基質中的多電荷蛋白質而過飽和，引起低質量離子的損失。為了解決這個問題，Kaufmann等重新優化樣品前處理方法，更徹底地沉淀樣品中的蛋白質，并使用填料顆粒孔徑更小的固相萃取柱。優化后的方法能夠檢測肌肉、肝臟、腎臟、魚肉和蜂蜜中100多種獸藥殘留，線性范圍、精密度、靈敏度均優于原來的TOF-MS方法，除了前處理方法的改進外，Orbitrap-MS提供的50 000FWHM分辨率和出色的質量穩定性也發揮了重要作用。

Peters等［37］建立了肉、魚、雞蛋中100種獸藥的UHPLC-TOF-MS檢測方法，在方法學驗證時有所改進，需要制備的樣品量少于原有樣品量的1/2。樣品用V（乙腈）∶V（水）＝6∶4的溶液提取，用Strata X固相萃取柱凈化，洗脫時肌肉和魚肉樣品用V（甲醇）∶V（乙腈）＝1∶1的溶液洗脫，而雞蛋樣品需要V（甲醇）∶V（乙酸乙酯）＝1∶1的溶液才能有效地將吸附的藥物洗脫。在4～400μg/kg濃度范圍內，目標化合物的平均質量誤差為3ppm，中值為2.5 ppm，濃度越高誤差越小，不同組織之間的差別不大。色譜的共流出物和藥物相互之間也會影響測定的精確質量誤差，目標化合物在雜質和藥物較集中的階段洗脫時，測定的質量誤差相對較大。對化合物的定性分析同時也使用了同位素匹配的方法，用SigmaFit值來判斷，SigmaFit值越小則匹配度越高。SigmaFit也是隨著濃度升高而降低的，但是不同的組織對SigmaFit有影響，基質越復雜SigmaFit越高。SigmaFit的平均值為0.04，中值為0.01，說明某些藥物的偏差較大。方法重復性的中值在8%～15%之間，隨著濃度升高而降低，而重現性的中值為15%～20%，不隨樣品和濃度的變化而變化。準確度的中值為70%～100%，92%目標化合物的線性相關系數大于0.99。

3 結論與展望

動物源性樣品中多類獸藥的大規模篩查和定量方法是解決樣品通量、減少消耗的有效途徑。應用高分辨質譜的全掃描和精確質量測定功能，結合超高效液相色譜技術，優化樣品前處理方法，可以實現100多種獸藥殘留的同時檢測。與四極桿質譜相比，高分辨質譜的參數設定簡單，并適用于非定向和未知化合物的篩選，需要增加目標化合物時，不必再次處理樣品和進樣，重新分析已有的全掃描數據即可。UHPLCHRMS作為最有潛力的分析技術，仍有很大的發展空間，TOF的分辨率和Orbitrap的掃描速度有待提高，簡便易用的數據處理軟件也需要完善。

［1］HO C，SIN D W M，WONG K M，et al.Determination of dimetridazole and metronidazole in poultry and porcine tissues by gas chromatography-electron capture negative ionization mass spectrometry［J］.Anal Chim Acta，2005，530：23-31.

［2］SHEN J Z，XIA X，JAING H Y，et al.Determination of chloramphenicol，thiamphenicol，florfenicol，and florfenicol amine in poultry and porcine muscle and liver by gas chromatography-negative chemical ionization mass spectrometry［J］.J Chromatogr B，2009，877：1 523-1 529.

［3］XIA X，LI X W，DING S Y，et al.Determination of 5-nitroimidazoles and corresponding hydroxyl metabolites in swine kidney by ultra-performance liquid chromatography coupled to electrospray tandem mass spectrometry［J］.Anal Chim Acta，2009，637：79-86.

［4］CHU P S，LOPEZ M I.Liquid chromatographytandem mass spectrometry for the determination of protein-bound residues in shrimp dosed with nitrofurans［J］.J Agric Food Chem，2005，53：8 934-8 939.

［5］WREN S A C，TCHELITCHEFF P.Use of ultra-performance liquid chromatography in pharmaceutical development［J］.J Chromatogr A，2006，1 119：140-146.

［6］GUILLARME D，NGUYEN D T T，RUDAZ S，et al.Recent developments in liquid chromatography：Impact on qualitative and quantitative performance［J］.J Chromatogr A，2007，1 149：20-29.

［7］WU N，CLAUSEN A M.Fundamental and practical aspects of ultrahigh pressure liquid chromatography for fast separations［J］.J Sep Sci，2007，30：1 167-1 182.

［8］NGUYEN D T T，GUILLARME D，RUDAZ S，et al.Fast analysis in liquid chromatography using small particle size and high pressure［J］.J Sep Sci，2006，29：1 836-1 848.

［9］YU K，LITTLE D，PLUMB R，et al.Highthroughput quantification for a drug mixture in rat plasma-a comparison of ultra performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry with high- performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry［J］.Rapid Commun Mass

Spectrom，2006，20：544-552.

［10］PETROVIC M，GROS M，BARCELO D.Multiresidue analysis of pharmaceuticals in wastewater by ultra-performance liquid chromatography－quadrupole-time of flight mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2006，1 124：68-81.

［11］LEANDRO C C，HANCOCK P，FUSSELL R J，et al.Quantification and screening of pesticide residues in food by gas chromatography-exact mass time-of-flight mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2007，1 166：152-162.

［12］NIELEN M W F，VAN ENGELEN M C，ZUIDERENT R，et al.Screening and confirmation criteria for hormone residue analysis using liquid chromatography accurate mass time-of-flight，Fourier transform ion cyclotron resonance and orbitrap mass spectrometry techniques［J］.Anal Chim Acta，2007，586：122-129.

［13］MAKAROV A.Electrostatic axially harmonic orbital trapping：A high-performance technique of mass analysis［J］.Anal Chem，2000，72：1 156-1 162.

［14］FERRER I，GARCIA-REYES J F，FERNANDEZ-ALBA A.Identification and quantitation of pesticides in vegetables by liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry［J］.Trends A-nal Chem，2005，24：671-682.

［15］GARCIA-REYES J F，HERNANDO M D，MOLINA-DIAZ A，et al.Comprehensive screening of target，nontarget and unknown pesticides in food by LC-TOF-MS［J］.Trends Anal Chem，2007，26：828-841.

［16］ANTIGNAC J P，MARCHAND P，LE BIZEC B，et al.Identification of ractopamine residues in tissue and urine samples at ultra-trace level using liquid chromatography－positive electrospray tandem mass spectrometry［J］.J Chromatogr B，2002，774：59-66.

［17］VAN POUCKE C，VAN PETEGHEM C.Development and validation of a multi-analyte method for the detection of anabolic steroids in bovine urine with liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］.J Chromatogr B，2002，772：211-217.

［18］KOOTSTRA P R，ZOONTJES P W，VAN TRICHT E F，et al.Multi-residue screening of a minimum package of anabolic steroids in urine with GC-MS［J］.Anal Chim Acta，2007，586：82-92.

［19］ANDERSEN J H，HANSEN L G，PEDERSEN M.Optimization of solid phase extraction clean up and validation of quantitative determination of corticosteroids in urine by liquid chromatographytandem mass spectrometry［J］.Anal Chim Acta，2008，617：216-224.

［20］TOUBER M E，VAN ENGELEN M C，GEORGAKOPOULUS C，et al.Multi-detection of corticosteroids in sports doping and veterinary control using high-resolution liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometry［J］.Anal Chim Acta，2007，586：137-146.

［21］KAUFMANN A，BUTCHER P，MADEN K，et al.Ultra-performance liquid chromatography coupled to time of flight mass spectrometry （UPLCTOF）：A novel tool for multiresidue screening of veterinary drugs in urine［J］.Anal Chim Acta，2007，586：13-21.

［22］STOLKER A A M，NIESING W，FUCHS R，et al.Liquid chromatography with triple-quadrupole and quadrupole-time-of-flight mass spectrometry for the determination of micro-constituents-a comparison［J］.Anal Bioanal Chem，2004，378：1 754-1 761.

［23］HOOIJERINK H，LOMMEN A，MULDER P P J，et al.Liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry based method for the determination of estradiol benzoate in hair of cattle［J］.Anal Chim Acta，2005，529：167-172.

［24］QIANG Z Y，SHENTU F Q，WANG B，et al.Residue depletion of ractopamine and its metabolites in swine tissues，urine，and serum ［J］.J Agric Food Chem，2007，55：4 319-4 326.

［25］ANIELSKI P，THIEME D，SCHLUPP A，et al.Detection of testosterone，nandrolone，and precursors in horse hair［J］.Anal Bioanal Chem，2005，383：903-908.

［26］DUNNETT M，LEES P.Retrospective detection and deposition of potentiated sulphonamides in equine hair by liquid chromatography［J］.Chromatographia，2004，59：S69-S78.

［27］GRATACOS M，CASTELLARI M，VALERO A，et al.Hair analysis for veterinary drug monitoring in livestock production［J］.J Chromatogr B，2006，834：14-25.

［28］VAN DER HEEFT E，BOLCK Y J C，BEUMER B，et al.Full-scan accurate mass selectivity of ultra-performance liquid chromatography combined with time-of-flight and orbitrap mass spectrometry in hormone and veterinary drug residue analysis［J］.J Am Soc Mass Spectrom，2009，20：451-463.

［29］STOLKER A A M，RUTGERS P，OOSTER INK E，et al.Comprehensive screening and quantification of veterinary drugs in milk using UPLC-ToF-MS［J］.Anal Bioanal Chem，2008，391：2 309-2 322.

［30］ORTELLI D，COGNARD E，JAN P，et al.Comprehensive fast multiresidue screening of 150 veterinary drugs in milk by ultra-performance liquid chromatography coupled to time of flight mass spectrometry［J］.J Chromatogr B，2009，877：2 363-2 374.

［31］HERMO M P，BARRON D，BARBOSA J.Determination of multiresidue quinolones regulated by the European Union in pig liver samples highresolution time-of-flight mass spectrometry versus tandem mass spectrometry detection［J］.J Chromatogr A，2008，1 201：1-14.

［32］ZHENG M M，RUAN G D，FENG Y Q.Evaluating polymer monolith in-tube solid-phase microextraction coupled to liquid chromatography/quadrupole time-of-flight mass spectrometry for reliable quantification and confirmation of quinolone antibacterials in edible animal food［J］.J Chromatogr A，2009，1 216：7 510-7 519.

［33］CARRASCO-PANCORBO A，CASADO-TERRONES S，SEGURA-CARRETERO A，et al.Reversed-phase high-performance liquid chromatography coupled to ultraviolet and electrospray time-of-flight mass spectrometry on-line detection for the separation of eight tetracyclines in honey samples［J］.J Chromatogr A，2008，1 195：107-116.

［34］HERNANDO M D，MEZCUA M，SUAREZBARCENA J M，et al.Liquid chromatography with time-of-flight mass spectrometry for simultaneous determination of chemotherapeutant residues in salmon［J］.Anal Chim Acta，2006，562：176-184.

［35］KAUFMANN A，BUTCHER P，MADEN K，et al.Quantitative multiresidue method for about 100 veterinary drugs in different meat matrices by sub 2－μm particulate high-performance liquid chromatography coupled to time of flight mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2008，1 194：66-79.

［36］KAUFMANN A，BUTCHER P，MADEN K，et al.Development of an improved high resolution mass spectrometry based multi-residue method for veterinary drugs in various food matrices［J］.Anal Chim Acta，2010.

［37］PETERS R J B，BOLCK Y J C，RUTGERS P，et al.Multi-residue screening of veterinary drugs in egg，fish and meat using high-resolution liquid chromatography accurate mass time-of-flight mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2009，1 216：8 206-8 216.

Advances on Application of Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry in Veterinary Drug Residues Analysis

XIA Xi，LI Xiao-wei，DING Shuang－yang，SHEN Jian-zhong
（National Reference Laboratory for Residues of Veterinary Drugs，College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing100193，China）

Liquid chromatography-high resolution mass spectrometry （LC-HRMS）has shown great potential of application in the field of veterinary drug residues analysis.This review focuses on the technical characteristics of LC-HRMS，and especially addressed its applications and prospect in the multi-residue screening of veterinary drugs.

veterinary drug residues；liquid chromatography；high resolution mass spectrometry

O 657.63

A

1004-2997（2011）06-0333-08

2011-08-19；

2011-10-14

夏 曦（1980～），男（漢族），講師，獸醫藥理毒理專業。E-mail：xxia＠cau.edu.cn

沈建忠（1963～），男（漢族），教授，獸醫藥理毒理專業。E-mail：sjz＠cau.edu.cn