HPLC法測定南方紅豆杉種子中紫杉醇的含量

張儉儉吳葉紅

（1中國人民武裝警察部隊學(xué)院醫(yī)院藥劑科，河北 廊坊 065000；2開灤（集團）有限責(zé)任公司醫(yī)院，河北 唐山 063000）

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters 2695-2996高效液相色譜儀，Empower工作站；KQ 3200DE型數(shù)控超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）；EYELA旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；電子天平（0.1mg BT 124S，0.01mg BP 211D，德國賽多利斯有限公司）；M ili-Q超純水儀。

1.2 南方紅豆杉種子采自江西，由河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院聶老師鑒定為Taxus chinensis var.mairei，樣品保存于河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院標(biāo)本室。1號為2004年采；2號為2006年采；3號為2009年采。紫杉醇對照品自制，NMR鑒定其結(jié)構(gòu)（純度＞98%，HPLC歸一化法）。甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件和系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

色譜柱：Whatman C18(250 mm×4.6 mm，5.0μm)。流動相：乙腈-水（35∶65-80∶20）梯度洗脫，運行時間30 min。柱溫：30℃。流速：1m L/min。紫杉醇檢測波長為227 nm。進(jìn)樣量為20μL。在該色譜條件下測定紫杉醇對照品溶液，南方紅豆杉種子供試品溶液，色譜圖見圖1。如圖所示，紫杉醇達(dá)到基線分離，理論板數(shù)分別為9 161，分離度分別為1.83。

2.2 對照品溶液及供試品溶液的制備

對照品溶液的制備 精密稱取對照品紫杉醇 3.40 mg，置于10m L量瓶中，色譜甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得紫杉醇對照品溶液（340μg/m L）。

供試品溶液的制備取南方紅豆杉種子細(xì)粉100 g（過40目篩），取該細(xì)粉5 g，精密稱定，置于三角瓶中，加甲醇50m L，稱重，超聲提取45m in，放冷，用甲醇補充減失的重量，濾過（0.45μm微孔濾膜），取續(xù)濾液備用。

2.3 線性范圍

取“2.2”中制備的對照品溶液1.0m L，采用倍比稀釋法制成系列質(zhì)量濃度的溶液，在“2.1”色譜條件下，取20μL注入液相色譜儀，分析并記錄結(jié)果(色譜峰面積)。以對照品濃度（X）(μg/m L)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得紫杉醇回歸方程為Y=3.93×104X－2.02×104，r=0.999 6，線性范圍：8.5～51.0μg/m L。

2.4 精密度試驗

圖1 紫杉醇對照品（a）和樣品色譜圖（b）（＊taxol）

取供試品約5 g，精密稱定，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次20μL，按“2.1”項下方法測定并計算含量。結(jié)果：紫杉醇含量的RSD為0.46%。

2.5 重復(fù)性試驗

取同一批藥材，按“2.2”項下方法，重復(fù)6次取樣制備供試品溶液，按“2.1”項下方法測定并計算含量，紫杉醇含量的RSD為1.68%。

2.6 回收率實驗

取已測知含量的同一批藥材6份，每份約0.25 g，精密稱定，按約等含量精密加入紫杉醇對照品，按“2.2”項下方法處理并測定紫杉醇含量，計算平均回收率，結(jié)果紫杉醇的平均回收率為99.7%，RSD為1.57%（n=6）。結(jié)果見表1。

2.7 穩(wěn)定性實驗

取供試品約5 g，精密稱定，按“2.2”項下方法處理得供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、24 h測定紫杉醇，記錄其峰面積，計算6次進(jìn)樣紫杉醇峰面積的RSD為1.63%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)含量基本保持穩(wěn)定。

表1 回收率實驗 (n＝6)

2.8 樣品含量測定

對不同年份采集的3批南方紅豆杉種子按“2.2”項下方法處理，在“2.1”色譜條件下進(jìn)行測定（n=3），計算樣品中紫杉醇的含量，結(jié)果：2004、2006和2009年采集的南方紅豆杉種子中紫杉醇的含量分別為0.019 6%、0.021 2%和0.020 5%。

3 討論

3.1 提取溶劑與方法的考察

比較了不同提取方法（索氏回流、連續(xù)加熱回流和超聲）、提取溶劑（甲醇、乙醇、二氯甲烷以及二氯甲烷-甲醇不同配比，如：3∶1，2∶1，1∶1），以及不同超聲提取時間（15、30、45、90m in）對提取效率的影響，結(jié)果表明10倍量甲醇超聲提取45min時各色譜峰的響應(yīng)值不再增加，且方法穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

比較了以下3種色譜柱：Whatman C18(250mm×4.6mm, 5.0μm)，Dikma Diamonsil C18(250mm×4.6 mm，5.0μm)，Hichrom C18(250mm×4.6mm，5.0μm)，結(jié)果表明色譜柱Whatman C18(250mm×4.6mm，5.0μm)能使藥材中紫杉醇達(dá)到較好的基線分離。流動相方面，甲醇-水體系無法實現(xiàn)紫杉醇的基線分離，而采用乙腈-水體系，通過調(diào)整梯度洗脫的時間和比例，則能使大多數(shù)成分達(dá)到良好分離。

本研究測定了不同年份采集的3批樣品中紫杉醇的含量，實驗結(jié)果表明：3批樣品中紫杉醇的含量略有差異但不大，說明藥材在保存得當(dāng)?shù)那闆r下，紫杉醇含量相對穩(wěn)定。測定方法準(zhǔn)確、靈敏、重復(fù)性好，為南方紅豆杉種子中紫杉醇的提取純化及藥材的進(jìn)一步研究與開發(fā)提供了依據(jù)。

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