紅曲霉粗多糖的提取及含量測(cè)定

高鑫 黃先智 李競(jìng)

（1西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶400715；2西南大學(xué)蠶學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)研究所，重慶400715）

紅曲霉（Monascus）在我國(guó)的應(yīng)用已經(jīng)有一千多年的歷史[1]，以能產(chǎn)生大量的天然紅色素而著稱。紅曲霉廣泛應(yīng)用于釀酒、釀醋、食品發(fā)酵、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)[2]。近幾十年來世界各地對(duì)紅曲霉進(jìn)行了大量研究，上個(gè)世紀(jì)70年代，日本遠(yuǎn)藤章教授從紅曲霉中分離出Monaclin K，具有降膽固醇作用[1]，引起了廣泛關(guān)注。隨著人們的食品安全意識(shí)的日益提升，紅曲霉生產(chǎn)的紅色素在綠色食品中得到廣泛應(yīng)用。

近些年來，經(jīng)科學(xué)工作者的研究證實(shí)，紅曲霉多糖具有抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、增強(qiáng)免疫等功能[3]。本實(shí)驗(yàn)通過提取紅曲霉發(fā)酵液和菌絲體內(nèi)的粗多糖，并對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定，以期為紅曲霉多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與試劑儀器

1.1 材料

紅曲霉菌種購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心，菌種保藏編號(hào)：30344。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 種子培養(yǎng)基 母種培養(yǎng)基為斜面PDA培養(yǎng)基。

1.2.2 液體搖瓶培養(yǎng)基 普通PDA培養(yǎng)基去瓊脂配方，MgSO41.5mg/L，KH2PO41.5 mg/L，VB110mg/L，自然pH。

1.3 儀器與試劑

ZD-85A氣浴恒溫振蕩器（金壇市富華儀器有限公司）、RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）、U-1800紫外分析儀（日本日立）、752N紫外可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、SHZ-ⅢD型循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）、KQ2200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市富華儀器有限公司）。三氯乙酸、苯酚、碳酸氫鈉、濃硫酸、葡萄糖、鋁片、活性炭等，所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 操作與培養(yǎng)方法

刮下斜面紅曲霉菌絲體，放入已滅菌的研缽中，研成碎塊，加入少許無菌水，研成均勻糊狀，精密吸取3 m L加入含有350 m L液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，封口，整個(gè)操作過程在無菌操作臺(tái)內(nèi)完成。將5個(gè)搖瓶放在25℃，170轉(zhuǎn)/min的搖床上往復(fù)式振搖7天。

2.2 紅曲霉粗多糖的提取

發(fā)酵液濾過，得菌絲體，加入水500 m L，超聲破碎細(xì)胞1小時(shí)，濾過，菌絲體加入500 m L水100℃浸提2次，每次1小時(shí)。合并4次濾液，減壓濃縮至100 m L，用10%三氯乙酸溶液調(diào)節(jié)pH至3，濾液放置冰箱24小時(shí)后，經(jīng)微孔濾膜濾過去蛋白質(zhì)沉淀，濾液加入乙醇，使含醇量達(dá)到80%，靜置過夜。經(jīng)微孔濾膜減壓抽濾，濾渣加熱水中溶解，依上法進(jìn)行醇沉，重復(fù)3次。濾渣加熱水溶解，加入1 g活性炭粉末除去色素，濾液濃縮醇沉，濾過，得淺紅色紅曲霉粗多糖，多糖平均得率為0.42 g。

2.3 紅曲霉多糖含量測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖對(duì)照品25.78 mg，置25 m L量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.2 5%苯酚溶液的制備[4-5]取苯酚100g，加鋁片0.1 g和碳酸氫鈉0.05 g，蒸餾。收集182℃餾分5g，置100 m L量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，避光保藏在冰箱中備用。2.3.3 供試品溶液的制備 精密稱取紅曲霉粗多糖9.68mg，置10m L量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.4 吸收波長(zhǎng)的選擇 分別精密吸取對(duì)照品溶液0.3 m L、供試品溶液0.2 m L，置10 m L量瓶中，加水至3 m L，精密加入5%苯酚溶液1 m L，搖勻；精密吸取硫酸5 m L迅速加入，振搖。冷卻后于沸水中加熱15分鐘，取出后冷卻，加水至刻線，搖勻。在400～550 nm進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，得對(duì)照品溶液、供試品溶液的最大吸收波長(zhǎng)都在490 nm，見圖1和圖2。

圖1 對(duì)照品溶液波長(zhǎng)掃描圖

圖2 供試品溶液波長(zhǎng)掃描圖

2.3.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對(duì)照品溶液0μL、50μL、100μL、200μL、300μL、400μL、500μL，置 10 m L量瓶中，加水至3 m L；精密加入5%苯酚溶液1 m L，搖勻；精密吸取硫酸5 m L迅速加入，振搖。冷卻后于沸水中加熱15分鐘，取出后冷卻，加水至刻度，搖勻。以相應(yīng)的試劑為空白，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。葡萄糖濃度 C分別為 0.005 2、0.010 4、0.020 8、0.031 2、0.041 6、0.052 0 mg/m L，其吸光度A值分別為0.110、0.180、0.324、0.439、0.590和0.699，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：A＝12.784 C＋0.049 8，r＝0.999 1。結(jié)果表明：葡萄糖濃度在0.005 2～0.052 0 mg/mL范圍內(nèi)，吸光度與濃度具有良好的線性關(guān)系。

2.3.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果吸光度A的RSD為0.26%，表明實(shí)驗(yàn)儀器精密度良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將供試品溶液，依法顯色后，每隔0.5小時(shí)測(cè)定吸光度A一次，連續(xù)測(cè)定6次。結(jié)果A值的RSD為0.67%，表明顯色后的樣品溶液在3小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取紅曲霉粗多糖6份，制成供試品溶液測(cè)定其含量，紅曲霉粗多糖中多糖的平均含量為63.81%，RSD為1.73%。

2.3.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品6份，分別按樣品中多糖含量的80%、100%、120%比例加入葡萄糖對(duì)照品溶液，平行操作2份，再按供試品溶液制備方法制備6份，測(cè)定其吸光度，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。根據(jù)所得結(jié)果，表明本法具有良好的回收率。

2.3.10 樣品含量測(cè)定 取紅曲霉粗多糖樣品5份，按照2.3.3項(xiàng)操作配制，精密吸取樣品溶液0.2 m L，按照2.3.5項(xiàng)配制樣品溶液，測(cè)定吸光度A值，計(jì)算出紅曲霉粗多糖中多糖的平均含量，結(jié)果見表2。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

3.1 本實(shí)驗(yàn)采用超聲波破碎菌體細(xì)胞和浸提相結(jié)合的方式，從而提高紅曲霉粗多糖的提取率，實(shí)驗(yàn)表明本提取方法效果良好。

3.2 制備多糖時(shí)常用Sevage法去蛋白，但此方法比較溫和，去蛋白率不高，常需多次操作，本實(shí)驗(yàn)采用三氯乙酸法去蛋白質(zhì)，去蛋白率高，但是三氯乙酸酸性強(qiáng)，需在低溫下操作，以防止多糖降解。

3.3 多糖的測(cè)定方法有多種，本實(shí)驗(yàn)采用多次水提醇沉的方法得到紅曲霉粗多糖，并通過苯酚-硫酸法顯色，在490nm最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定其含量，結(jié)果具有準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好，簡(jiǎn)便快速等優(yōu)點(diǎn)，可作為紅曲霉多糖含量的測(cè)定方法。

[1] 紀(jì)遠(yuǎn)中.紅曲及紅曲霉的研究現(xiàn)狀及進(jìn)展 [J].天津藥學(xué)，2005，17（2）：65-67.

[2] 趙東，胡曉龍，彭志云，等.淺談紅曲霉在白酒中的應(yīng)用[J].釀酒，2010，37（2）：11-13.

[3] 張建峰，昌友權(quán)，陳光，等.紅曲多糖的免疫活性研究[J].食品科學(xué)，2008，29（2）：391-393.

[4] 郭小群.苯酚-硫酸顯色法測(cè)定多糖[J].廣東化工，2010，37（5）：207.