孕酮對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠血腦屏障通透性及腦水腫的影響

李新娟，李 爽，李東亮

(新鄉醫學院生理學與神經生物學教研室，河南新鄉 453003)

缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是導致新生兒死亡及神經系統后遺癥的主要原因，此病的治療尚無長足進步，目前仍以綜合支持治療為主［1］。近年來研究發現孕酮(progesterone，PROG)除調節生殖功能外，還可作用于中樞神經系統［2－3］。PROG 對腦缺氧缺血的保護作用，也引起人們的極大關注［4］。本課題前期研究發現，PROG預處理可提高缺氧缺血(hypoxic-ischemic，HI)新生大鼠腦組織中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性［5］。本實驗通過觀察PROG對HI新生大鼠血腦屏障(blood brain barrier，BBB)通透性、腦含水量和腦皮質水孔通道蛋白4(aquaporins-4，AQP4)表達的影響，來探討PROG腦保護作用的可能機制，為更好預防與治療新生兒HIE提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑PROG(Sigma公司)，伊文思藍(evans blue，EB，Serva公司)，兔抗鼠 AQP4 多克隆抗體、SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程公司)。

1.2 動物分組與給藥方法7 d Sprague-Dawley(SD)大鼠96只，♂♀不限，體質量11～16 g，由新鄉醫學院實驗動物中心提供，隨機分成4組:正常組、假手術組、HI組和PROG組。各組隨機分為3個亞組(n=8)，分別用于BBB通透性、腦含水量的測定和免疫組織化學法觀察AQP4的表達。PROG組于建模型前30 min按8 mg·kg－1腹腔注射PROG芝麻油液，其余各組注射等容積芝麻油。

1.3 動物模型的制備［6］新生大鼠經乙醚麻醉后，背位固定于手術臺，體積分數為0.75乙醇消毒，頸部正中切開皮膚，分離皮下肌肉，于胸鎖乳突肌內側深部分離右頸總動脈，并于近端和遠端結扎右頸總動脈，在中間剪斷，消毒縫合，立即將動物置于37℃，80 ml·L－1氧氣和 920 ml·L－1氮氣的低氧箱內2 h，而后繼續母乳喂養。假手術組僅在頸部正中切開皮膚、分離右側頸總動脈，不結扎，不予缺氧。HI后24 h作以下檢測。

1.4 BBB通透性測定［7］經大鼠心腔注射20 g·L－1EB生理鹽水溶液(20 mg·kg－1)1 h后，數秒鐘后可見大鼠眼睛皮膚變成藍色。1 h后，處死大鼠，迅速斷頭取腦，將右側腦組織稱重，加入2倍體積甲酰胺，50℃水浴中孵育72 h，取上清，用分光光度計，635 μmol·L－1處檢測吸光度，繪制標準曲線。根據標準曲線計算出待測樣品的EB含量，結果以每克濕重腦組織中所含EB的微克數(μg·g－1)表示。

1.5 腦含水量測定新生大鼠經乙醚麻醉后，斷頭取腦，分析天平稱濕重后置于110℃恒溫干燥箱內干燥24 h至恒重，稱dry wt后按Elliot公式計算腦含水量:腦含水量/%=(wet wt－dry wt)/wet wt×100%

1.6 大鼠大腦皮質AQP4蛋白的表達新生大鼠經乙醚麻醉后，斷頭取腦，將右側腦組織置于40 g·L－1多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)中4℃固定過夜，常規梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸臘、包埋、5 μm厚連續冠狀切片。免疫組織化學SABC法觀察大腦皮質AQP4的表達。每只動物取3張腦組織切片，400倍光鏡下隨機觀察皮質2個不同視野，數碼相機拍照，HMIAS-200彩色圖像分析系統對染色結果進行分析，計算其平均光密度值(mean optic density，MOD)。

1.7 統計學處理實驗數據用±s表示，以SPSS13.0軟件進行方差分析。

2 結果

2.1 孕酮對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠BBB通透性的影響正常組和假手術組BBB通透性差異無顯著性(P＞0.05);與假手術組相比，HI組BBB通透性明顯升高(P＜0.01);與HI組相比，PROG組腦組織BBB通透性明顯降低(P＜0.05)，結果見Tab 1。

2.2 孕酮對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠腦含水量的影響正常組和假手術組腦含水量差異無顯著性(P＞0.05);HI組腦含水量明顯高于假手術組(P＜0.01);PROG組腦含水量明顯低于HI組(P＜0.05)，結果見 Tab 1。

Tab 1 Effects of PROG on BBB permeability，BWC and expression of AQP4 in cerebral cortex after hypoxic-ischemic brain damage in newborn rats(±s，n=8)

Tab 1 Effects of PROG on BBB permeability，BWC and expression of AQP4 in cerebral cortex after hypoxic-ischemic brain damage in newborn rats(±s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs sham operated;△P＜0.05 vs HI

Group EB contents/μg·g－1 BWC/%AQP4(MOD)Normal 13.11 ±2.28 87.606 ±1.254 0.293 ±0.045 Sham operated 16.33 ±2.40 87.877 ±1.021 0.289 ±0.051 HI 146.73 ±10.34＊＊92.317 ±1.035＊＊ 0.452 ±0.053＊＊PROG 8 mg·kg－1 133.78 ±8.20△ 89.233 ±1.091△ 0.375 ±0.056△

2.3 孕酮對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠腦皮質AQP4表達的影響免疫組化圖片顯示，AQP4主要表達于微血管周圍星形膠質細胞，陽性細胞呈圓形、橢圓形，胞膜著色，胞質、胞核不著色。正常組腦皮質AQP4的表達和假手術組相比差異無顯著性(P＞0.05);HI組腦皮質AQP4的表達明顯高于假手術組(P＜0.01);PROG組腦皮質AQP4的表達明顯低于 HI組(P ＜0.05)，結果見 Tab 1，Fig 1。

Fig 1 Effects of PROG on expression of AQP4 in cerebral cortex after hypoxic-ischemic brain damage in newborn rats(ABC×400)

3 討論

BBB的破壞是缺血性腦損傷的重要病理生理機制之一［8］。腦損傷腦水腫是一種混合性水腫，與BBB通透性的增加密切相關［9］。本實驗發現，假手術組腦組織EB含量和腦含水量與正常組相比較差異無顯著性，提示單純手術并未影響BBB通透性和腦含水量;而HI組腦組織EB含量和腦含水量明顯高于假手術組，說明HI后BBB結構破壞、通透性增加，引起腦水腫;孕酮組腦組織EB含量和腦含水量明顯低于HI組，說明孕酮確實具有腦保護作用，然而孕酮對腦保護作用的分子機制和途徑尚不清楚。

水通道蛋白(aquaporin，AQP)是一組與水通透有關的細胞膜轉運蛋白，在介導水跨胞膜的流動中起關鍵作用，其中AQP4是介導腦組織中水分子流動的主要水通道蛋白。有研究表明［10］AQP4可能構成BBB的第2道隔膜，起調節水運輸的作用;另有研究表明［11］腦損傷后腦內微環境改變導致AQP4表達上調，使細胞膜結構改變，BBB通透性增加，對水的通透性增強，本實驗也證實，HI組腦皮質AQP4蛋白表達上調，腦水腫明顯。這些實驗結果強烈提示HIBD后可能通過上調AQP4表達而使BBB通透性增加，進而發生腦水腫。

Yamad［12］已證實抑制AQP4的表達可減緩腦水腫的形成，從而降低神經系統疾病的病死率和致殘率;Verkman等［13］也證明AQP4基因敲除可使由急性水中毒或缺血中風引起的腦腫脹明顯減輕，說明抑制AQP4的表達，可抑制或減輕AQP4引起的腦水腫。因此如何抑制AQP4的表達，成為減輕腦損傷后腦水腫的關鍵。本實驗發現，給予外源性PROG，HIBD新生大鼠BBB通透性和腦含水量明顯低于HI組，且給予外源性PROG可明顯抑制腦皮質AQP4的表達，提示PROG可能通過下調HIBD新生大鼠腦皮質AQP4的表達而減輕BBB損傷，緩解腦水腫。這可能是PROG對HIBD的保護作用機制之一，以上結果為臨床新生兒HIE的治療提供了一定的理論和實驗依據。

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