人唾液α-淀粉酶與紅/綠茶多酚相互作用的吸附動力學研究

林鋒 姚江武

（廈門市口腔醫院 修復科，廈門 361003）

人唾液α-淀粉酶與紅/綠茶多酚相互作用的吸附動力學研究

林鋒 姚江武

（廈門市口腔醫院 修復科，廈門 361003）

目的 探索茶黃素（TF）和表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）與人唾液α-淀粉酶（HSA）反應所引起的口腔收斂性感覺的驅動力。方法 利用表面等離子共振儀（SPR）和吸附動力學原理，測量Langmuir、Freundlich吸附等溫線常數（KL、Kf和Mm）和吸附反應速率及平衡常數（ka、kd、KA和KD）。結果 TF和EGCG在2種模型下的相關決定系數之間的差異無統計學意義（P＞0.05），均適用于描述TF和EGCG的吸附現象。TF的吸附等溫線常數、結合速率和結合平衡常數均大于EGCG（P＜0.05），解離速率和解離平衡常數均小于EGCG（P＜0.05）。結論 紅茶中的TF比綠茶中的EGCG更易造成口腔黏膜強烈的收斂性感覺，其驅動力來源于多酚結構中的羥基的氫鍵結合和酰基的疏水性反應。

茶黃素； 表沒食子兒茶素沒食子酸酯； 表面等離子共振儀； 人唾液α-淀粉酶

紅茶和綠茶是中國人最喜愛的兩種茶，其有效成分為茶多酚。茶黃素（theaflavin，TF）和表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）分別占紅茶和綠茶茶多酚成分的12%和50%[1]。人唾液α-淀粉酶（human salivaryα-amylase，HSA）是水解淀粉和糖原酶類的總稱，因其在口腔獲得性膜的形成和生長過程中也發揮了重要作用，從而受到口腔研究者的廣泛關注[2]。飲茶時口腔分泌的唾液蛋白質不足以中和茶多酚，則形成茶多酚-蛋白質沉淀物，并覆蓋于口腔黏膜表面，產生干燥和皺縮感[2-3]，因此，茶多酚與唾液蛋白質反應并形成復合物的研究顯得十分重要。在以往的研究中，茶多酚吸附于唾液蛋白質表面的分子水平上的報道十分罕見，近年來由于新方法的應用，如：橢偏儀、消散因子石英晶體微天平、表面等離子共振儀（surface plasmon resonance，SPR）等，使得茶多酚與蛋白質反應的研究達到了原位、實時和動態[4]。本研究利用SPR和吸附動力學原理，以TF和EGCG為紅茶和綠茶中茶多酚的代表化合物，將其吸附于HSA表面，探索TF和EGCG與HSA反應所引起的口腔收斂性感覺的驅動力，為了解紅茶和綠茶茶多酚引起口腔收斂性感覺的分子機制提供依據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

HSA（批號EC3.2.1.1），N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS），1、3-二甲基氨基丙基-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽[1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodiimide hydrochloride，EDC]，PBST（phosphate bufferd saline with Tween 20）緩沖液（Sigma公司，美國）。≥98%TF（紅茶提取物，Woko公司，日本）；99%EGCG（綠茶提取物，廈門勛健中藥植物化學有限公司）。

SPR（SR7000DC型，Reichert公司，美國）；Millipore Direct-Q3超純水器（Millipore公司，法國）。

1.2 組裝HSA[5]

通入1mL的體積比為1∶1的0.2mol·L-1EDC和0.1mol·L-1NHS混合溶液，活化SPR芯片（CMD500m型）10min。注入1mL的HSA溶液至吸附達到穩態，再注入1mol·L-1pH 8.5的乙醇胺鹽酸溶液1mL，維持封閉10min。排空乙醇胺，并通入20mmol·L-1pH 2.0的鹽酸溶液以去除非特異性結合的HSA。至此，在活化的SPR芯片表面形成了由HSA組裝的蛋白質生物膜。

1.3 SPR監測

在25℃、pH值為7.0、離子強度為10mmol·L-1PBST的條件下，分別注入不同質量分數（20、30、40、50、60μmol·L-1）的TF和EGCG溶液，大約30 min后吸附達到穩態，記錄響應強度對時間的函數關系曲線。

1.4 芯片的再生[6]

通入0.1mol·L-1磷酸1mL，并保持2 min。當HSA表面吸附的多酚被移除后，系統響應強度將回到緩沖液基線水平。再生的芯片用于再吸附。

1.5 吸附等溫線常數

Langmuir吸附等溫線公式[7]：C/M=1/KLMm+C/Mm。Freundlich吸附等溫線對數公式[8]：lg M=lg Kf+1/n lg C。上述2個公式中：C是被吸附溶液的濃度；M是吸附量；KL是Langmuir吸附常數，反映吸附過程的強度；Mm為飽和狀態的最大吸附量；1/n是常數；Kf是Freundlich吸附常數，意義同KL。繪制C/M對C和lg M對lg C的等溫線，由函數關系圖得出直線的斜率和截距，求得吸附等溫線常數KL、Mm、Kf和1/n。

1.6 反應速率和平衡常數

芯片上配體與分析物反應形成復合物的速率公式為[9]：d[AB]/d t=ka[A][B]-kd[AB]，即：d R/d t=kaCRmax-（kaC+kd）R。式中A是分析物TF和EGCG，B是傳感片表面固定的配體HSA，AB為形成的復合物TF-HSA和EGCG-HSA，C為分析物TF和EGCG的質量分數，Rmax為芯片上形成最多復合物時所得到的響應，R為時間t時所得到的響應。以d R/d t對R作圖可得到一條直線，其斜率即為表觀吸附常數Kobs，且Kobs=-（kaC+ kd）。以-Kobs對C作圖，同樣可以得到一條直線，其斜率即為吸附反應速率常數ka，截距為解離反應速率常數kd。可根據關系式[9]：KA=ka/kd，KD=kd/ka，求得反應平衡常數（結合平衡常數KA和解離平衡常數KD）。

1.7 統計學分析

采用SPSS 13.0軟件對Langmuir和Freundlich模型吸附等溫線相關決定系數（R2）、吸附等溫線常數（KL、Mm和Kf）、反應速率及平衡常數（ka、kd、KA和KD）進行配對t檢驗，檢驗水平α=0.05。

2 結果

2.1 吸附模型的比較

不同濃度的TF和EGCG吸附于HSA表面的響應強度與時間的關系見圖1。從圖1可見，隨著時間的推移，吸附響應強度逐漸增大，直到達到平衡；伴隨著TF和EGCG的濃度增加，吸附響應強度也相應增大。

圖1 不同濃度的TF和EGCG吸附于HSA表面的響應強度與時間的關系Fig 1 The response unit versus time response for TF and EGCG adsorption on HSA surfaces at various TF and EGCG concentrations

TF和EGCG吸附于HSA表面的動力學模型的相關決定系數比較見表1。統計分析表明，TF和EGCG在2種模型下的相關決定系數之間的差異無統計學意義（P＞0.05），表明Langmuir和Freundlich吸附模型均適用于描述TF和EGCG的吸附現象。

表1 TF和EGCG吸附于HSA表面的動力學模型的相關決定系數比較Tab 1 Com parison of the correlation coefficient of determ ination for the kinetic model for TF and EGCG adsorption on HSA surfaces

2.2 吸附等溫線常數的比較

TF和EGCG吸附于HSA表面的Langmuir和Freundlich吸附等溫線見圖2。根據圖2求得的吸附等溫線常數（KL、Mm和Kf）見表2。結果顯示，TF的吸附等溫線常數均大于EGCG（P<0.05），表明TF與HSA的親合性高于EGCG。

圖2 TF和EGCG吸附于HSA表面的Langmuir（上）和Freundlich（下）吸附等溫線Fig 2 Adsorption isotherm of TF and EGCG adsorption on HSA surfaces fitted to the Langmuir model（up）and the Freundlich model（down）

表2 TF和EGCG吸附于HSA表面的吸附等溫線常數（K L、M m和K f）的比較Tab 2 Com parison of the constants of adsorption isotherm（K L，M m and K f）for TF and EGCG adsorption on HSA surfaces

2.3 反應速率及平衡常數的比較

根據速率公式繪制圖3，反應速率常數（ka和kd）和反應平衡常數（KA和KD）的統計結果見表3。結果顯示：TF的結合速率和結合平衡常數均大于EGCG（P<0.05），解離速率和解離平衡常數均小于EGCG（P<0.05），表明TF與HSA反應形成復合物的速度大于EGCG，且吸附反應達到平衡后形成復合物的量也大于EGCG。TF和EGCG的結合速率比解離速率分別高5和4個數量級，而結合平衡常數分別比解離平衡常數分別高9和7個數量級，表明TF和EGCG吸附于HSA表面的結合反應是可逆的，但是可逆的程度很弱，且TF與HSA的結合比EGCG更緊密些，即TF與HSA的親合性高于EGCG。

圖3 表觀吸附常數與TF和EGCG濃度的關系Fig 3 The relation between the apparent adsorption constant and TF/EGCG concentrations

表3 TF和EGCG吸附于HSA表面的反應速率（k a和k d）及平衡常數（K A和K D）的比較Tab 3 Com parison of the rate（k a and k d）and equilibrium constants（K A and K D）of the reaction for TF and EGCG adsorption on HSA surfaces

3 討論

3.1 TF和EGCG膜的特性

固體-液體界面的吸附過程可用Langmuir和Freundlich模型描述。Langmuir模型認為吸附層是單層膜，一個吸附劑分子與一個吸附質分子對應結合，它代表了均勻的表面吸附分子間彼此沒有相互作用的情況下，單分子層吸附達到平衡時的規律[8]。Freundlich模型是一個經驗式，除了適用于單分子層吸附，也可應用于多分子層和表面不均勻的吸附過程[8]。本實驗結果證實：Langmuir和Freundlich模型均能用于描述TF和EGCG的吸附過程，因此可以初步判斷：1）HSA表面吸附的TF和EGCG膜為單層膜，且一個TF或EGCG分子與一個HSA分子對應結合；2）可以用2種吸附模型的等溫線常數判斷TF和EGCG吸附于HSA表面的親和性。反應速率常數的統計結果表明：TF和EGCG在HSA表面形成單層膜的速度非常快，且TF大于EGCG，提示飲用紅茶后，其成分中的TF將比綠茶中的EGCG更迅速地吸附于口腔黏膜表面，形成茶多酚單層膜，從而啟動口腔黏膜強烈的干燥和皺縮的收斂性感覺。而TF單層膜從HSA表面解離下來的速度非常小，則表明TF單層膜的穩定性大于EGCG，飲用紅茶造成的收斂性感覺的持續時間將比綠茶長。

3.2 TF/EGCG與HSA的親和性

親和性常數從不同角度描述了TF和EGCG與HSA的親和性：Langmuir和Freundlich吸附常數（KL和Kf）反映了親和性反應的激烈程度；飽和狀態的最大吸附量（Mm）反映了與HSA結合后生成TF和EGCG單層膜的量；反應平衡常數（KA和KD）則從飽和吸附狀態描述了親和性反應過程。各常數的統計結果（表2、3）表明：TF與HSA之間的親和性大于EGCG，這是由于：1）TF為紅茶多酚的多聚體，分子結構中有9個羥基，而EGCG為綠茶多酚的單聚體，分子結構中有8個羥基。由于羥基能夠與HSA分子的活性中心裂隙處的氨基酸極性基團（酰胺、胍、肽、氨基、羧基）發生氫鍵結合，因而分子結構中羥基多者，與蛋白質的親和性更好[10]；2）TF亞類TF-3有2個酰基，TF-2A和TF-B各有1個酰基，而EGCG沒有酰基，一方面酰基能與HSA蛋白質分子中疏水性的氨基酸產生疏水性作用[11]；另一方面酰基能夠為位于HSA蛋白質（-3）/（-2）、（-1）/（+1）、（-1）/（+2）位點的色氨酸59、酪氨酸62、151殘基提供TF積聚反應的條件[12]；3）TF的相對分子質量大于EGCG的相對分子質量[13]，就同一蛋白質而言，大分子量的茶多酚為蛋白質結合能夠提供較多的結合位點，因而與蛋白質的親合性就好[14]。TF和EGCG與HSA的親和性比較結果表明：紅茶中的TF比綠茶中的EGCG更易與HSA結合形成多酚-HSA復合物，覆蓋于口腔黏膜表面會造成強烈的干燥和皺縮感，覆蓋于牙齒表面形成色素生物膜會影響美觀。

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（本文編輯 李彩）

Adsorption kinetic study of the interaction between human salivaryα-amylase and the polyphenoles from the black/green tea

LIN Feng,YAO Jiang-wu.（Dept.of Prosthodontics,Dentistry Hospital of Xiamen City,Xiamen361003,China）

ObjectiveTo explore the driving force of the oral astringency produced by the interaction of theaflavin（TF）and epigallocatechin-3-gallate（EGCG）to human salivaryα-amylase（HSA）.MethodsThe constants of the rate,equilibrium of reaction（ka,kd,KA,andKD）and Langmuir,Freundlich adsorption isotherm（KL,Kf,andMm）were determined by surface plasmon resonance（SPR）technique and adsorption kinetics.Results Both of Langmuir and Freundlich models could be used for describing the binding processes of TF and EGCG onto HSA surfaces,and there were no significant differences of the correlation coefficient of determination between these two models（P＞0.05）.The constants of adsorption isotherm,the rate and equilibrium constants of the association for TF were higher than those of EGCG（P＜0.05）.The rate and equilibrium constants of the dissociation for TF were lower than those of EGCG（P＜0.05）.The affinity of TF to HSA was higher than that of EGCG.ConclusionThe sorely oral astringency is much easily produced by TF from the black tea rather than EGCG from the green tea.The driving force of the oral astringency is attributed to the hydrogen bonds of hydroxyl groups and hydrophobic interaction of galloyl groups in polyphenolic structures.

theaflavin； epigallocatechin-3-gallate； surface plasmon resonance； human salivaryα-amylase

R 783.2

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.01.002

1000－1182（2011）01－0005-04

2010-03-10；

2010-06-25

林鋒（1975—），男，福建人，主治醫師，碩士

林鋒，Tel：13063048749