膠原-羥磷灰石復合膜引導骨組織再生的動物實驗研究

金瓊王曉敏 王曉飛 李旭東 麻健豐

（1.溫州醫學院附屬口腔醫院 口腔修復科，溫州 325027；2.四川大學 生物材料工程技術研究中心，成都 610064）

膠原-羥磷灰石復合膜引導骨組織再生的動物實驗研究

金瓊1王曉敏2王曉飛1李旭東2麻健豐1

（1.溫州醫學院附屬口腔醫院 口腔修復科，溫州 325027；2.四川大學 生物材料工程技術研究中心，成都 610064）

目的 探討自制膠原-羥磷灰石（COL-HA）復合膜修復SD大鼠顱骨缺損的效果。方法 在24只SD大鼠的顱頂骨上各制備4個缺損，其中左、右側缺損區分別覆蓋COL-HA復合單層致密膜（第2組）和COL-HA復合雙層膜（第3組），額骨缺損區保留作為空白對照（第1組），枕骨缺損區覆蓋Bio-Gide膜作為對比（第4組）。術后2、4、8、12周各處死6只大鼠取材，進行肉眼觀察、X線檢查、組織切片觀察和新生骨量測定，對結果進行廣義線性模型/析因設計方差分析和LSD-t檢驗。結果 從術后2周開始除第1組外，其余3組均可見少量新生骨質，12周時3組缺損區由不透明硬組織封閉，并可見分解的部分膜碎片。X線顯示，術后12周時第3組和第4組缺損區修復骨密度與原骨質接近，第2組稍低。新生骨量分析顯示，術后初期第4組新生骨量大于其余3組，術后12周第4組與第3組和第2組的成骨量無統計學差異。結論 COL-HA復合膜能引導大鼠顱骨組織再生，且復合雙層膜成骨效果要優于復合單層致密膜，其結構更有利于成骨細胞的附著和生長。

引導骨組織再生； 膠原； 羥磷灰石； 骨缺損

種植術前骨量不足和種植術中、術后種植體周圍骨缺損是影響種植成功率的主要因素。近年來，膜引導骨組織再生（guide bone regeneration，GBR）技術的運用使上述問題得到了解決，大大提高了種植成功率，擴大了口腔種植的適應證[1-2]；膜材料的性能亦成為口腔種植學研究的熱點。羥磷灰石（hydroxyapatite，HA）作為骨替代材料目前已被廣泛接受，其不僅具有良好的生物相容性和生物活性，而且還具有骨傳導性，能引導新骨從宿主骨沿植入界面向植入體內部生長，通過形成磷灰石層與周圍骨組織形成良好的骨鍵合[3-4]，但HA單獨使用時存在手術中不易塑形、固位難等問題。膠原（collagen，COL）膜已被證明是良好的GBR膜材料[5]，與HA復合可增加HA的固位，同時可提高膜的強度，且無機相的羥磷灰石具有良好的骨引導能力，可促進骨組織的再生[6-7]。

本實驗采用原位礦化纖維凝膠途徑制得COLHA復合單層致密膜和COL-HA復合雙層膜，使其具有與自然骨相似的成分和結構，并與Bio-Gide膜的成骨效果進行比較，探討原位礦化纖維凝膠COLHA復合膜材料應用于臨床的可行性和引導骨組織生成的效果。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

COL-HA復合單層致密膜（厚0.04 mm，直徑8mm）和COL-HA復合雙層膜（厚0.20～0.30mm，直徑8mm）由四川大學生物材料工程技術研究中心研制提供。Bio-Gide膜（Geistlish公司，瑞士）。

1.2 動物模型

選取健康的3月齡SD雄性成年大鼠24只（重為420～480 g），按每100 g重量給10%水合氯醛0.3mL腹腔注射麻醉。剪除顱頂部的毛發，消毒，鋪巾，沿頭顱正中做切口，在骨膜下向兩側翻瓣，用種植機配直徑5mm的空心鉆在生理鹽水沖洗冷卻下，于SD大鼠顱頂骨上制備4個直徑5mm的圓形貫通骨缺損，2個骨缺損邊緣間距為2～3mm，術中勿傷及下方硬腦膜。在4處骨缺損區中，左、右側骨缺損區分別覆蓋COL-HA復合單層致密膜（第2組）和COLHA復合雙層膜（第3組），額骨缺損區保留作為空白對照（第1組），枕骨缺損區覆蓋Bio-Gide膜作為對比（第4組），將膜與骨面貼合，嚴密縫合（圖1）。術后3 d，每天2次予以肌肉注射慶大霉素2萬單位抗感染。

1.3 實驗觀察與測試

分別在術后2、4、8、12周各處死6只大鼠，完整切取顱頂骨，進行肉眼觀察，并用10%甲醛固定24 h，進行X線檢查，每次檢查時都由同一名技師拍片，再將標本置入20%乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）溶液中脫鈣，沿缺損中央分切，然后水洗、脫水、石蠟包埋，制作5μm的連續切片12張，其中4張用于常規蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosine，HE）染色，8張用于改良Masson染色，光鏡下觀察。采用圖像分析軟件Image-Pro Plus6.0對Masson染色結果進行新生骨定量分析，隨機選取每組各時間點切片3張，每張切片隨機選取3個40倍視野，測量積分光密度（成骨量）和新骨面積。

圖1 大鼠顱骨缺損模型制備Fig 1 Preparation of rat cranial defect model

1.4 統計學分析

采用SPSS 13.0統計軟件對數據進行廣義線性模型/析因設計方差分析和LSD-t檢驗，檢驗水平α= 0.05。

2 結果

2.1 肉眼觀察

所有創口均為Ⅰ期愈合，無1例發生術后感染或排異反應。

術后2周：第2、3、4組膜形態均完整連續，缺損邊緣生成較多稚嫩纖維組織，缺損中央為半透明纖維膜封閉，3組之間無明顯差異。第1組缺損區周圍可見增生的肉芽組織。

術后4周：第2組膜形態不清晰，破碎呈濕沙狀，與肌層粘連，外表纖維包裹較厚，周圍長入大量肉芽組織，缺損中央為半透明纖維膜封閉；第3組膜形態不清晰，破碎呈泥狀，其余表現同第2組；第4組膜形態隱約可見，與骨組織部分融合，表面與肌層粘連，缺損區由不透明骨樣組織封閉，針刺稍有阻力；第1組纖維覆蓋缺損區，周圍長入大量增生的肉芽組織。

術后8周：第2組和第3組膜的形態消失，呈小顆粒碎渣，缺損區由不透明骨樣組織封閉，邊緣不清晰，探針刺入阻力大；第4組膜形態不清晰，與骨組織融合，質地較堅韌，缺損區由不透明硬組織封閉，探針刺入困難；第1組缺損區由半透明纖維組織占據，針刺無阻力。

術后12周：第2、3、4組表現無明顯差異，膜形態消失，但仍可見分解的部分膜碎片，缺損區由不透明硬組織封閉，邊緣不清晰，針刺不入；第1組缺損部分由軟組織封閉。

2.2 X線檢查

術后2周除第1組呈現暗影外，其余3組骨缺損邊緣均表現少量骨性陰影。隨著愈合時間的增加，缺損區骨修復逐漸增多，12周時新骨生成最多，骨密度最高。術后12周：第2組修復骨影像呈云霧狀，骨密度較原骨質低；第3組和第4組缺損區修復骨密度與原骨質接近；第1組淺表暗影，與原骨質分界明顯（圖2）。

2.3 組織學觀察

術后2周：第2、3、4組骨缺損邊緣可見少量新生骨質，新骨呈細的骨小梁及編織骨狀態；第1組骨缺損內基本為纖維組織所占據，并可見炎癥細胞浸潤，缺損端少量成骨。

圖2 術后2周（左）和12周（右）時的X線片Fig 2 X-ray films at 2 weeks（left）and 12 weeks（right）after surgery

術后4周：第2組骨缺損區編織狀骨逐漸增多，骨小梁較細，新生骨向中央逐漸充填骨缺損；第3組缺損內可見較多新生的編織骨及板層骨；第4組缺損中央有大量新生骨質，大部分為編織骨，向中央逐漸充填骨缺損；第1組缺損斷端有少量新生骨，致密纖維包裹（圖3）。

圖3 術后4周的組織學觀察 Masson ×40Fig 3 Histological observation at 4 weeks after surgery Masson ×40

術后8周：第2組骨缺損的邊緣雖有部分新骨生成，但中央區由束狀膠原纖維連接；第3組新骨量增多，骨小梁也逐漸增寬，逐漸充填缺損區；第4組成骨明顯增加，新生骨質更加成熟，新骨在缺損中央接近匯合；第1組缺損斷端骨質致密化，為纖維所包裹（圖4）。

術后12周：第2、3、4組均可見部分分解的GBR膜材料。第2組新生骨增多，并逐漸充填骨缺損區，骨質變成熟；第3組骨缺損區新生骨明顯增多，骨小梁增寬，并向板層骨過渡，新骨在缺損中央部分匯合；第4組骨缺損區可見成熟的編織骨及板層骨，成骨明顯增加，接近形成完整的骨橋連接；第1組骨缺損區可見新骨形成，骨小梁較細，表面由纖維包裹（圖5）。

2.4 成骨量和成骨面積的定量分析

各實驗組術后不同時間點的成骨量見圖6。對各組成骨量進行統計分析，結果表明：術后2周第4組成骨量明顯大于第1組和第2組；術后4周第4組成骨量明顯大于其他3組；術后8周第4組成骨量明顯大于其他3組，第3組明顯大于第1組；術后12周第4組成骨量大于第1組，與第3組和第2組無統計學差異。他3組，第3組大于第1組；術后12周第4組成骨面積大于第1組，與第3組和第2組無統計學差異。

圖6 各實驗組術后不同時間點的成骨量Fig 6 Quantify of regenerate bone at different time points in four groups

各實驗組術后不同時間點的成骨面積見圖7。統計分析表明，術后2周各組成骨面積無明顯區別；術后4周第4組成骨面積明顯大于第1組和第2組，第3組大于第1組；術后8周第4組成骨面積明顯大于其

圖7 各實驗組術后不同時間點的成骨面積Fig 7 Area measurement of regenerate bone at different time points in four groups

3 討論

本實驗使用的大鼠為3月齡的SD雄性成年大鼠。在一般的開放飼養條件下，大鼠的壽命為2.5～3年，無菌大鼠壽命可達4年。以人60歲為老年年齡，大鼠進入老年的相應時間為1.7年，即20個月。成年大鼠一般常用2～12月齡者，處于成年期的大鼠整體機體機能都處于最佳的狀態。雖然雌雄各半實驗組更具有群體的代表性，但考慮雌性大鼠激素水平不同可能存在骨組織代謝的差異，同時參考學者[5，8-9]的實驗研究，選擇成年雄性SD大鼠來制作實驗模型。

下頜骨是骨缺損研究的常用模型，但是大鼠下頜骨比較薄，為2個相融的皮質骨板，缺乏骨髓骨源性細胞和生長因子，且植入物固位較困難，同時下頜切牙根較長，彎至下頜骨體，易被損傷，很不易操作；而顱骨結構與下頜骨類似，在胚胎學上均為膜內成骨方式成骨；在解剖學上，顱骨為兩層皮質骨內間隔骨松質；在生理上，顱骨的皮質骨類似于萎縮的下頜骨。因此，顱骨是檢測下頜骨缺損修復材料修復效果的常用部位[10]。Busch等[8]為評價大鼠頂骨直徑5 mm的缺損是否可靠，在5～6月齡雄性Wistar大鼠雙側頂骨避開矢狀竇，各造成一個5mm的骨缺損，術后6及12個月時發現除了缺損邊緣有極少量骨形成外，并未出現自發性骨再生現象。本實驗選擇在成年雄性SD大鼠顱骨上造成5mm的圓形骨缺損，術后12周時空白對照組缺損內大部分為纖維組織占據，阻止了缺損內成骨性細胞的成長，很難自行達到骨愈合。這說明：利用SD大鼠顱骨缺損模型研究檢測骨修復材料成骨效果，具有實際指導意義。

COL-HA復合膜是基于礦化膠原纖維凝膠的復合類骨材料研究方法所制得的，同時結合了膠原自組裝形成纖維網絡凝膠和羥磷灰石的原位礦化，所制得的膜具有良好的機械性能[11]。COL-HA復合單層致密膜和復合雙層膜的拉伸強度分別為（53.40± 8.80）MPa和（2.50±0.28）MPa，濕態強度為（1.86± 0.40）MPa和（0.21±0.07）MPa[12]，并具有一定的空間維持能力。前期體外成骨細胞培養結果表明，COLHA復合膜具有良好的生物相容性，細胞在材料表面生長形態良好。在本實驗中COL-HA復合膜在植入后8周開始分解，12周組織切片仍可見部分膜分解碎片，未見明顯的炎癥細胞浸潤。作為一種可吸收的GBR膜材料，它必須要有適宜的降解時間以維持足夠長的時間（最少6周）引導缺損區新骨生成，過早分解會使得原本被GBR膜所隔離的纖維細胞重新爬入骨缺損區，阻礙新生骨生成，影響成骨效果[13]。本研究中COL-HA復合膜在術后12周仍未完全分解，說明它具有良好的降解性能，有利于引導骨組織生成，且材料及降解產物不會引起周圍組織的不良反應，生物相容性良好。

本實驗中對切片不但進行了HE常規染色，還進行了Masson染色。因組織成分的不同，將骨基質染成紅色，骨髓染成黃色，纖維組織染成藍色，借此明確識別骨缺損中的組織[14-15]。在計算機輔助圖像分析系統上能方便指出新骨結構，測量更加客觀。本研究表明，第2組和第3組的成骨面積和成骨量無明顯差異。術后初期第4組新生骨量明顯大于第1、2組，但從術后12周第2組和第3組的新生骨量明顯增加，與第4組的差異不再有統計學意義。COL-HA復合雙層膜組新生骨略大于COL-HA致密膜組，但并不具有統計學差異，這可能是由于COL-HA復合雙層膜一側致密光滑，一側多孔疏松。致密層可以將成纖維細胞阻擋于膜外，發揮GBR膜的屏障作用，而疏松層具有多孔結構，與組織的接觸面積更大，比致密膜具有更強的鈣磷釋放能力，同時源自骨膜或骨髓的骨生成細胞更易于在多孔膜表面貼附，增殖分化為成骨細胞，成骨細胞沿膜內表面爬行，分泌類骨基質，并在復合膜釋放鈣的環境下逐漸礦化[11]，形成細胞外基質，從而使骨缺損得以愈合。但在本實驗中兩者差異尚不具有統計學意義。

本實驗中第2、3、4組均采用缺損區外層單面蓋膜，如圖5組織學切片所示，術后12周大部分樣本未達到完全骨性愈合。這可能是由于缺損區內側未蓋膜，使得腦組織突入缺損內，影響了骨組織修復。該結果與李樹春等[9]研究骨形態發生蛋白與膠原膜復合物修復大鼠顱骨缺損實驗的結果相符，他們采用雙側覆蓋復合膜和外側單面覆蓋復合膜進行平行對照，結果術后4、6周雙側蓋膜組的成骨百分比明顯大于單側蓋膜，且雙側蓋膜組在術后6周已達骨性愈合。因此在以后的動物實驗中可考慮增加雙側蓋膜組進行對比。

本研究表明，COL-HA復合膜作為可吸收性GBR膜，具有良好的生物相容性及機械性能，且COL-HA復合雙層膜的引導骨組織修復能力優于復合單層致密膜，具有更好的臨床應用前景。但COLHA復合雙層膜的引導骨組織再生作用仍稍遜于Bio-Gide膜，其原因有待更深入的研究，以進一步改善COL-HA復合膜的性能。

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（本文編輯 李彩）

The efficacy of collagen-hydroxyapatite com posite membrane on bone regeneration

JIN Qiong1,WANG Xiao-min2,WANG Xiao-fei1,LI Xu-dong2,MA Jian-feng1.（1.Dept.of Prosthodontics,Hospital of Stomatology, Wenzhou Medical College,Wenzhou325027,China;2.Biomaterial and Engineering Research Center in Biomaterial,Sichuan University,Chengdu610064,China）

ObjectiveTo investigate the efficacy of a new collagen-hydroxyapatite（COL-HA）composite membrane on bone regeneration of SD rat cranial defects.MethodsFour defects were produced in the calvaria of 24 SD rats.The animals were divided into four groups:Empty defects without membrane（group 1）;defects covered by COL-HA single-layer dense membranes（group 2）;defects covered by COL-HA double-layer membranes（group 3）; defects covered by Bio-Gide membranes（group 4）.At 2,4,8 and 12 weeks after surgery,6 rats were sacrificed and the following parameters were analyzed:Macroscopic observation,X-ray examination,descriptive histology,regenerate bone quantitative histology.Statistical analysis consisted of generalized linear models/factorial design analysis of variance and LSD-ttest was performed.Results Since two weeks after surgery,there were a small amount of bone regenerated in three groups except group 1.At 12 weeks after surgery,the opaque sclerous tissues filled with the defects in three groups,and residual membrane fragments still could be found.X-ray pictures showed the density of regenerate bone in group 3 and group 4 was closed to the original bone and greater than that of group 2. Quantitative analysis of regenerate bone showed that in initial stage,group 4 had more bone regeneration than the other groups（P<0.05）,and at 12 weeks after surgery the differences between group 4 and group 2/group 3 had no statistically significant.ConclusionThe COL-HA composite membranes can guide bone regeneration of rat cranial defects.The efficacy of bone regeneration of COL-HA double-layer membrane is superior to COL-HA single-layer densemembrane,because its property ismore propitious to the adherence and proliferation of osteoblasts.

guide bone regeneration； collagen； hydroxyapatite； bone defect

1000－1182（2011）01－0021-06

Q 81

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.01.006

2010-03-09；

2010-06-25

金瓊（1984—），女，浙江人，碩士

麻健豐，Tel：0577-88063033

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