福賽斯坦納菌在2型糖尿病患者齦下菌斑中的分布

馬麗 張建全 潘亞萍，3

（1.中國醫科大學口腔醫學院 口腔生物學教研室，沈陽 110002；2.天津市寶坻區人民醫院 口腔科，天津 301800；3.中國醫科大學口腔醫院 牙周科，沈陽 110002）

福賽斯坦納菌在2型糖尿病患者齦下菌斑中的分布

馬麗1張建全2潘亞萍1，3

（1.中國醫科大學口腔醫學院 口腔生物學教研室，沈陽 110002；2.天津市寶坻區人民醫院 口腔科，天津 301800；3.中國醫科大學口腔醫院 牙周科，沈陽 110002）

目的 觀察福賽斯坦納菌（T.forsythensis）在2型糖尿病患者不同牙周狀況下的分布及其與相關影響因素的關系，探討T.forsythensis在慢性牙周炎與2型糖尿病中的作用。方法 采集160例不同牙周狀況的2型糖尿病患者的齦下集合菌斑，采用酚-氯仿法提取細菌DNA，應用聚合酶鏈反應法對T.forsythensis進行檢測。采用Pearson相關和Logistic回歸等統計方法分析T.forsythensis與牙周及全身狀況的相關性。結果 160例糖尿病患者中，T.forsythensis在牙周健康組未檢出，在輕度牙周炎組檢出率為47.82%，中度牙周炎組為48.71%，重度牙周炎組為67.39%。重度牙周炎組的檢出率明顯高于輕、中度組（P<0.05）。與T.forsythensis獨立相關的因素有簡化口腔衛生指數和糖尿病病程，OR值分別為1.947、0.873。結論T.forsythensis在2型糖尿病牙周炎患者中的分布與口腔衛生狀況、牙周破壞程度及糖尿病病程有關。

2型糖尿病； 慢性牙周炎； 福賽斯坦納菌

福賽斯坦納菌（Tannerella forsythensis，T.forsythensis）是一種革蘭陰性厭氧桿菌，是牙周疾病重要的致病菌之一，與牙周炎的發生發展密切相關。本課題組前期研究[1]發現：在同等程度的牙周炎癥下，T.forsythensis在伴2型糖尿病的牙周炎患者中的檢出率及相對數量明顯高于無糖尿病的牙周炎患者。為探討T.forsythensis增多的可能原因，本研究采用以16S rRNA為基礎的聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術檢測160例2型糖尿病患者不同牙周狀況下T.forsythensis的分布情況，分析T.forsythensis與牙周臨床指標及糖尿病相關指標的關系，進一步探討T.forsythensis在慢性牙周炎與2型糖尿病中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑、儀器和試驗菌株

PCR反應相關試劑（包括Tag DNA聚合酶、10× PCR緩沖液、dNTP）和DNA相對分子質量標準DL2000，均購自日本TaKaRa公司。主要實驗儀器為PCR擴增儀（Tgradient型，Biometra公司，德國）、自動凝膠成像分析儀（GDS8000型，UVP公司，美國）。采用國際參考標準菌株T.forsythensis ATCC 43037作為陽性對照，變異鏈球菌作為陰性對照。以上菌株均來自中國醫科大學口腔中心實驗室菌種保存中心。

1.2 研究對象的選擇

樣本源自2007年7—12月在遼寧省莊河、盤錦、康平及沈陽大東地區的城鎮和農村，采用時點橫斷面研究方法對2型糖尿病患者的牙周狀況進行現場調查的人群。按本試驗要求選取并納入受試者160例，年齡為33～73歲，平均年齡為（53.84±9.60）歲；其中男65例，女95例；初診為2型糖尿病者99例，有2型糖尿病病史者61例。

受試者要求符合以下條件：無全身其他系統性疾病，婦女非妊娠期，未服用避孕藥；近半年內未做過牙周治療；3個月內未服用過抗生素；無明顯咬合關系異常；試驗前需簽署知情同意書。2型糖尿病的診斷標準[2]：空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）≥7.0mmol·L-1和（或）糖耐量實驗2 h血糖（oral glucose tolerance test 2 h blood glucose，OGTT 2 h BG）≥11.1mmol·L-1。

牙周健康者要求符合以下條件：全口牙探診深度（probing depth，PD）≤3 mm，無臨床附著喪失（clinical attachment loss，CAL），齦溝出血指數（sulcus bleeding index，SBI）≥2的位點不超過10%，無SBI≥4的位點[3]。參照Armitage等[4]推薦的診斷標準，將慢性牙周炎患者細分為以下3組。1）輕度牙周炎組：平均CAL為0.6～1.59mm，無鄰面部位CAL≥3mm，缺失牙不超過3顆。2）中度牙周炎組：平均CAL為1.60～2.49mm，口內至少3個區或至少6顆牙齒CAL≥3mm，但CAL≥3mm的部位鄰面不超過8個，缺失牙不超過5顆。3）重度牙周炎組：平均CAL≥2.5mm，口內3個區有1個或多個部位鄰面CAL≥5mm，缺失牙不超過14顆。

1.3 問卷調查

口腔檢查前所有受試者均要求接受統一的問卷調查。問卷內容除性別、年齡等一般情況外，還包括家庭月收入，吸煙、飲酒情況，口腔衛生習慣，糖尿病史及用藥情況等。

1.4 生化指標檢測及體格檢查

1.5 檢查者校準及口腔檢查

1.6 齦下菌斑的收集和DNA的提取

1.7 試驗引物

試驗引物參見Ashimoto等[6]的設計。T.forsythensis特異性引物序列為：（F）5’-GCGTATGTAACCTGCCCGCA-3’，（R）5’-TGCTTCAGTGTCAGTTATACCT-3’，PCR擴增產物為641 bp；細菌通用引物序列為：（F）5’-ATTAGATACCCTGGTAGTCCAC-3’，（R）5’-CCCGGGAACGTATTCACCG-3’，擴增產物為602 bp。本試驗引物由大連寶生物技術有限公司合成。

Moving the known items in Eq.(1)to the left of the equal sign gets

1.8 PCR擴增及產物的檢測

PCR反應在25μL反應體系中進行，95℃預變性2min后，進入主循環：95℃變性45 s，58.5℃退火1min，72℃延伸60 s。35個循環后72℃延伸10min。質量分數1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。紫外燈下觀察結果并經自動凝膠成像分析儀拍照，應用電泳凝膠成像分析軟件Fluorchem V2.0分析各電泳條帶的平均灰度值（average gradation，AVG）。計算T.forsythensis特異性引物與該菌斑通用引物的PCR產物的AVG比值，以分析齦下菌斑中T.forsythensis所占比例在不同組間的差異[5]。

1.9 質量控制

每批PCR擴增均設置陽性對照、陰性對照和空白對照。所有試驗樣本的測定均在盲法下進行，并用隨機數字表法隨機抽取10%的樣本做重復試驗，檢測PCR結果的可靠性。T.forsythensis特異性引物與通用引物的PCR產物在同一凝膠上同時進行3次電泳，取平均值為最終灰度值比值。

1.10 統計分析

采用SPSS 11.5軟件進行統計分析，統計方法采用t檢驗、χ2檢驗、Pearson相關性分析和Logistic回歸分析等，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 牙周檢查及PCR檢測結果

160例2型糖尿病患者中，牙周健康者6例，慢性牙周炎154例，其中輕度牙周炎23例，中度39例，重度92例。牙周炎的患病率為96.25%。160例患者的年齡和牙周檢查結果見表1。

表1 受試者的年齡及牙周檢查結果Tab 1 The age and the clinical periodontal index of subjects ±s

表1 受試者的年齡及牙周檢查結果Tab 1 The age and the clinical periodontal index of subjects ±s

分組 例數 年齡/歲 PD/mm CAL/mm SBI OHI-S輕度牙周炎 23 49.2±9.5 2.22±0.65 1.20±0.29 1.06±0.49 1.09±0.49中度牙周炎 39 52.8±9.4 2.51±0.06 2.06±0.27 1.20±0.58 1.45±0.46重度牙周炎 92 56.0±9.2 2.88±0.55 3.67±0.95 1.76±0.64 1.89±0.64牙周健康 6 46.3±2.4 2.00±0.15 0.38±0.05 0.93±0.10 1.08±0.12

T.forsythensis部分PCR產物的電泳結果見圖1。分別采用T.forsythensisATCC 43037的DNA、變異鏈球菌DNA和無菌雙蒸水作為陽性、陰性和空白對照。

圖1 T.forsythensis特異性引物檢測電泳圖Fig 1 Electrophoresis results of PCR products with T.forsythensisspecific primer

T.forsythensis在牙周健康組未檢出；在輕度牙周炎組檢出11例，檢出率為47.82%；在中度牙周炎組檢出19例，檢出率為48.71%；在重度牙周炎組檢出62例，檢出率為67.39%。重度牙周炎組的檢出率明顯高于輕、中度牙周炎組（P<0.05）。

2.2 影響T.forsythensis定植的相關因素分析

2.2.1T.forsythensis與牙周及口腔衛生狀況的關系本組研究對象中，牙周狀況、口腔衛生狀況及生活習慣與T.forsythensis的關系見表2。

表2 T.forsythensis的分布與受試者的牙周指數、OHIS及相關生活習慣的關系Tab 2 Relationship between the distribution of T. forsythensis and periodontal index,OHI-S and related habits

T.forsythensis陽性患者的PD、CAL、OHI-S明顯高于陰性患者（P<0.05）；T.forsythensis檢出情況與吸煙、飲酒等與口腔健康相關的生活習慣無關，與每天刷牙次數及刷牙時間也無關。另外，經Pearson相關性分析，T.forsythensis特異性引物與菌斑通用引物的AVG比值與OHI-S呈正相關（r=0.405，P= 0.001）。

2.2.2T.forsythensis與血糖、血脂、血壓的關系T. forsythensis檢出情況與患者的血糖、血脂、血壓的關系見表3。由表3可見：T.forsythensis陽性患者的TC水平明顯高于陰性患者（P=0.002）。另外，經Pearson相關性分析，T.forsythensis特異性引物與菌斑通用引物的AVG比值與FBG呈正相關，且有統計學意義（r=0.275，P=0.033）。

表3 T.forsythensis的分布與受試者的基本情況及全身因素的關系Tab 3 Relationship between the distribution of T. forsythensis and demographic,system ic conditions of subjects

2.2.3T.forsythensis的分布與年齡、性別、居住地區、家庭月收入、糖尿病病程等基本資料的關系T.forsythensis的分布與受試者基本情況的關系見表3。T.forsythensis的檢出率農村明顯高于城鎮（P= 0.001）。另外，T.forsythensis特異性引物與菌斑通用引物的AVG比值農村患者明顯高于城鎮患者（P= 0.001），男性明顯高于女性（P=0.001）。T.forsythensis陽性患者的糖尿病病程短于T.forsythensis陰性患者（P=0.006），初診為糖尿病的患者的T.forsythensis檢出率明顯高于有糖尿病病史的患者（P=0.005）。

2.3 Logistic多變量回歸分析

3 討論

T.forsythensis是牙周炎最重要的微生物危險因素之一，也是目前公認的牙周炎證據最為充分的三大主要致病菌之一。Smith等[7]用PCR方法檢測伴糖尿病的慢性牙周炎患者的齦下菌斑，T.forsythensis檢出率為50%。Hintao等[8]用棋盤式DNA-DNA雜交法檢測伴2型糖尿病的重度牙周炎患者，T.forsythensis檢出率為69.9%。本試驗中，重度牙周炎組T.forsythensis的檢出率為67.39%，接近Hintao等[8]的結果，可能與檢測人群同為亞洲人有關。目前國內對2型糖尿病患者T.forsythensis的檢測報道還較少，楊禾等[9]曾對單純的重度牙周炎病變位點的齦下菌斑進行檢測，T.forsythensis檢出率為56.5%。

本試驗中，T.forsythensis在伴2型糖尿病的牙周炎標本中同樣有較高的檢出率，并隨牙周炎癥程度的增加而逐漸增加，這種趨勢與不伴有糖尿病的牙周炎情況相似。由此可見：T.forsythensis也是伴2型糖尿病的慢性牙周炎患者口腔中重要的致病菌。至于T.forsythensis在牙周健康的2型糖尿病患者口腔中的分布情況，本試驗中該類患者只有6例，尚未檢測到T.forsythensis。楊禾等[9]在牙周及全身健康人群的T.forsythensis檢出率為10.9%；本研究在前期試驗中，40例健康者中有5例檢出T.forsythensis。

研究[10-11]顯示：T.forsythensis與牙周附著喪失明顯相關。Machtei等[12]報道：如果在基線時檢測到T. forsythensis，則意味著牙周袋深度增加的危險增大了7倍，以后發生牙槽骨喪失就比較顯著；同時，T. forsythensis的檢出率與牙周袋深度有關，牙周袋越深則T.forsythensis檢出率越高。Klein等[13]用PCR方法檢測不同牙周狀況齦下菌斑中T.forsythensis的情況，結果發現：任何健康部位都沒有檢出T.forsythensis，而牙周袋深度小于5mm的牙周病變部位T.forsythensis檢出率為70%，牙周袋深度大于或等于5mm部位的檢出率為100%。本試驗結果表明：在2型糖尿病患者中，T.forsythensis的檢出情況與多種牙周檢測指標如PD、CAL、OHI-S相關，這與其他學者在單純慢性牙周炎中的研究結果一致。

本試驗采用多種統計方法進行分析，結果顯示：T.forsythensis與性別、居住地區、FBG、TC、OHI-S及糖尿病病程有相關性。將以上相關因素用Logistic逐步回歸去除因素間的相互影響后，顯示T. forsythensis與性別、居住地區、FBG和TC均不相關，只與OHI-S和糖尿病病程獨立相關。分析其原因，可能是因為本組研究對象中農村患者的OHI-S及TC水平明顯高于城市患者[14]，這些因素的作用導致了T.forsythensis與居住地區、TC水平相關的假陽性結果。與糖尿病相關的指標TC及FBG與T.forsythensis未獨立相關，提示糖尿病患者的高血糖狀態可能并不直接影響T.forsythensis的定植，而是通過影響牙周組織的炎癥程度等其他途徑間接引起2型糖尿病患者中T.forsythensis檢出率偏高的現象。另外，本試驗受試者的糖尿病持續時間相對較短，T.forsythensis與機體血糖的相互影響尚不充分，也可能是導致陰性結果的重要原因。

有學者[15]提出糖尿病患者齦下菌群的數量及細菌種類與血糖、血脂的相關性與糖尿病病程、牙周損害程度有關，即糖尿病病程越長，牙周損害越重，這種相關性就越強；反之，在糖尿病病程較短、牙周損害較輕的病例中，細菌與血糖、血脂并無明顯相關性，且齦下菌群的數量與糖尿病的血糖水平也無明顯差異。臨床資料也顯示，糖尿病病程較短、牙周損害較輕的病例，兩者治療效果的相互影響并不明顯。由此看來：疾病持續時間可能在糖尿病和牙周炎的相互影響以及牙周可疑致病菌與2種疾病的相互影響中發揮重要作用。本試驗未嚴格限定2種疾病的持續時間，尤其確認慢性牙周炎的病程較為困難，可能給結果帶來一定偏差，在以后的研究中應將病程因素充分考慮。至于本研究中T. forsythensis與糖尿病病程存在獨立相關性這種現象，是2型糖尿病對T.forsythensis的影響結果，還是2型糖尿病發生的重要原因，尚待進一步研究。

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（本文編輯 胡興戎）

Prevalence of Tannerella forsythensis in subgingival p laque of type 2 diabetic patients

MA Li1,ZHANG Jian-quan2,PAN Ya-ping1，3.（1.Dept.of Oral Biology,School of Stomatology,China Medical University,Shenyang110002,China;2.Dept.of Stomatology,Baodi People’s Hospital of Tianjin,Tianjin301800,China;3.Dept.of Periodontics,School of Stomatology,China Medical University,Shenyang110002,China）

ObjectiveTo study the prevalence ofTannerella forsythensis（T.forsythensis）in the subgingival plaque of type 2 diabetes,analyze the relationship betweenT.forsythensisand related factors,discuss the role ofT.forsythensisin the chronic periodontitis and type 2 diabetes.Methods160 subgingival plaque samples were collected from type 2 diabetic patients and pathogens genomic DNA were extracted by phenol and chloroform from plaque.T. forsythensiswas detected by polymerase chain reaction,and Pearson correlation and Logistic regression analysis were used to analyze the relationship betweenT.forsythensisand systemic factors and periodontal status.Results The prevalence ofT.forsythensisin mild,moderate,severe periodontitis group was 47.82%,48.71%,67.39%respectively,and the prevalence was higher in the severe periodontitis group than in mild,moderate group（P<0.05）.There was noT.forsythensisin 6 diabetic patients with healthy periodontium.Logistic regression analysis illustrated that the prevalence ofT.forsythensiswas associated with simplified oral hygiene index（OHI-S）and diabetic duration（OR= 1.947,OR=0.873）.ConclusionThe prevalence ofT.forsythensisin type 2 diabetes with chronic periodontitis was related with oral hygiene,periodontal status and diabetic duration.

type 2 diabetes； chronic periodontitis；Tannerella forsythensis

R 781.4

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.01.014

1000－1182（2011）01－0057-05

2010-02-12；

2010-07-15

國家“十一五”科技支撐計劃基金資助項目（2007-BAI-18B02）；遼寧省科學技術計劃基金資助項目（2007225007）

馬麗（1979—），女，遼寧人，碩士

潘亞萍，Tel：024-22891701