維甲酸誘導腭裂相關wnt和成纖維細胞生長因子配體表達的動態變化

沈璐 叢蔚 王如 肖晶

（1.大連醫科大學口腔醫學院 口腔基礎教研室，大連 116044；2.大連醫科大學附屬第一醫院 口腔科，大連 116011）

維甲酸誘導腭裂相關wnt和成纖維細胞生長因子配體表達的動態變化

沈璐1叢蔚1王如2肖晶1

（1.大連醫科大學口腔醫學院 口腔基礎教研室，大連 116044；2.大連醫科大學附屬第一醫院 口腔科，大連 116011）

目的 篩選與維甲酸誘導腭裂相關的wnt和成纖維細胞生長因子（FGF）信號分子，觀察其在正常腭突發育和維甲酸誘導腭裂形成不同階段的表達動態變化。方法 建立維甲酸誘導腭裂小鼠模型，制作基因芯片并篩選wnt和FGF信號通路相關基因。根據芯片結果選出wnt經典通路配體wnt3和wnt8a、FGF通路配體fgf9和fgf10，并應用半定量逆轉錄-PCR（RT-PCR）技術檢測其在胚胎天數（ED）13.5～15.5中表達變化。結果 1）ED14.5實驗組腭突組織芯片分析結果顯示：wnt3和fgf10表達水平上調，wnt8a和fgf9表達水平下降。2）在ED13.5～15.5正常對照組腭突發育的不同階段，上述基因呈現持續性高表達，表達水平呈動態變化。3）在ED13.5～15.5的實驗組腭裂發生的不同階段，上述基因的表達水平與正常對照組均有差異（P＜0.05）。結論 wnt和FGF信號分子通路參與小鼠胚胎繼發腭的正常發育過程，在維甲酸誘導的腭裂發生過程中，存在維甲酸通路與wnt和FGF通路的相互作用。

腭裂； 動物模型； 信號分子； 基因篩選

先天性唇腭裂是通過基因與環境因素交互作用造成的多基因易感性疾病。維甲酸（retinoic acid，RA）是維生素A的衍生物，被廣泛應用于化療藥物、皮膚病的治療藥物以及化妝品的添加劑中，是新生兒發生唇腭裂的常見環境因素之一，而維甲酸致畸作用是通過基因調控達成的。維甲酸與其膜受體結合，經細胞漿內的維甲酸結合蛋白運輸到核內，最終通過基因轉錄調控來實現的，SHH等信號分子通路中的重要基因都被證明參與到維甲酸致腭裂的過程[1]。

wnt信號分子家族調控著胚胎多種組織的發育過程，包括細胞命運的轉化、細胞增殖、細胞極性及細胞遷移。wnt/β-Catenin通路又被稱為wnt經典通路，由wnt1、wnt3a和wnt8等配體激活，主要通過穩定核內β-Catenin而活化目的基因，是目前研究最多的wnt通路[2]。成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）和其受體組成了龐大而復雜的信號分子家族，在進化中高度保守，在頜面部神經嵴細胞的遷移、存活和增殖，上皮間充質相互作用及模式發育中起著重要作用[3]。目前研究證明wnt和FGF信號分子通路直接調控正常腭的發育過程，但在維甲酸誘導的小鼠腭裂發生過程中的動態表達變化尚未見報道。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級ICR小鼠，雄鼠20只，雌鼠40只，由大連醫科大學SPF實驗動物中心提供。

1.2 實驗用藥

全反式維甲酸（Sigma公司，美國），基因表達譜芯片（Affymetrix公司，美國），TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0試劑盒（日本寶生物公司），引物合成訂于上海英駿生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠腭裂模型的建立 選取10周齡左右SPF級ICR小鼠，按雌雄比例2∶1合籠，陰栓陽性的雌鼠記為胚胎0 d（embryo day 0，ED0）。于ED10，按照100mg·kg-1體重對孕鼠進行維甲酸灌胃，對照組孕鼠給予植物油作為對照[1]。分別于ED13.5、14、14.5、15、15.5脫頸處死孕鼠，剖宮取出胚鼠。獲得孕鼠總數為30只，對照組及實驗組各15只，對照組獲取胚鼠總數為164只，實驗組獲取胚鼠總數為181只。

1.3.2 基因芯片組織收集及數據處理 在體視顯微鏡下，使用DEPC處理過的器皿，分離ED14.5對照組及實驗組胚鼠的腭突組織，置于Trizol中，液氮速凍，組織收集完畢后送至上海生物芯片有限公司進行基因芯片制作。芯片數據結果以Signal Log Ratio≥1或≤-1，即實驗組表達水平較正常對照組上調或下調2倍以上，作為篩選差異表達基因的標準。

1.3.3 半定量逆轉錄-PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）實驗 提取ED13.5～15.5胚鼠腭突組織總RNA，反轉錄合成cDNA。設計wnt3、wnt8a、fgf9、fgf10基因和內參GAPDH的引物用于擴增（表1）。GAPDH的反應條件為94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃30 s，24個循環；wnt3和wnt8a反應條件為94℃ 45 s，59℃ 45 s，72℃ 1min，35個循環；fgf9和fgf10反應條件為94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物目的片段，UVP凝膠成像體系觀察并拍攝結果，Vision Works LS軟件測定條帶灰度值，利用SPSS 10.0軟件對數據進行統計學分析，采用秩和檢驗比較組間表達差異，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

表1 引物序列及反應條件Tab 1 Primer set and condition

2 結果

2.1 組織學變化

正常對照組ICR小鼠的ED13.5～14為腭突的垂直生長期，ED14～15為腭突上抬后的水平生長期，自ED15腭突發生接觸，腭中嵴上皮融合形成上皮帶，至ED15.5腭中嵴上皮細胞消失，雙側腭突完全融合。實驗組腭裂的發生率為100%，在ED14～15.5，雙側腭突呈水平向，但是因腭突較短小，未發生接觸融合而形成完全性腭裂。

2.2 芯片分析結果

在ED14.5實驗組和對照組腭突組織芯片分析結果中，選取了wnt和FGF信號分子家族表達變化顯著的4個配體，其中wnt3和fgf10在實驗組中表達水平上調，wnt8a和fgf9在實驗組中表達水平下降。

2.3 半定量RT-PCR結果

在ED13.5～15.5的對照組正常腭突發育的不同階段，wnt3、wnt8a、fgf9和fgf10呈現持續性高表達，表達水平呈動態變化（圖1）。變化趨勢如下：1）wnt3在垂直生長期表達水平呈上升趨勢，進入水平生長期呈下降趨勢，至雙側腭突接觸時，表達水平降至最低，在接觸融合期表達又呈上升趨勢；2）wnt8a在垂直生長期表達水平呈下降趨勢，進入水平生長期呈先上升后下降的波動，至雙側腭突接觸時，表達水平降至最低，在接觸融合期表達又呈上升趨勢；3）fgf9表達水平隨著腭突發育呈持續性下降，在垂直生長期和接觸融合期下降陡度最大；4）fgf10在垂直生長期表達水平呈上升趨勢，進入水平生長期呈先下降后上升的波動，至雙側腭突接觸時，表達水平升至最高，在接觸融合期表達又呈下降趨勢。

圖1 對照組不同階段的RT-PCR產物電泳圖Fig 1 Electrophprese figure of RT-PCR products for wild type in diffent stages

在ED13.5～15.5的實驗組腭裂發生的不同階段，wnt3、wnt8a、fgf9和fgf10的表達水平與正常對照組均有差異，結果具有統計學意義（P＜0.05）（圖2、3）。變化趨勢如下：1）wnt3在腭突的發育全過程中，均高于正常對照；2）wnt8a在垂直生長期表達水平快速下降后，維持低水平表達，在腭突的發育全過程中，均低于正常對照；3）fgf9在生長早期表現為與對照組相似的持續性下降趨勢，表達水平低于對照組；但在水平生長后期出現異常的高表達，在接觸融合期表現為與對照組相似的趨勢；4）fgf10在腭突的發育全過程中與對照組表達趨勢一致，表達水平均高于正常對照。

圖2 實驗組不同階段的RT-PCR產物電泳圖Fig 2 Electrophprese figure of RT-PCR products for RA-treated group in diffent stages

3 討論

在人類胚胎發育中，wnt3基因表達缺失會導致胎兒四肢缺失、顱面部畸形及唇腭裂發生[4]。wnt3主要參與胚胎體軸的形成，wnt3基因敲除小鼠胚胎出現四肢缺如，在頜面部發育早期wnt3即特異性出現在中鼻突末端及上下頜突的外胚層[5]。在本研究中，wnt3在正常小鼠腭突發育中呈持續高表達，證明了wnt3可能直接參與腭突發育，wnt3在腭間充質細胞快速增殖的垂直生長期表達水平呈上升趨勢，提示了wnt3可能與腭間充質細胞增殖和腭延伸相關，這與wnt3基因敲除小鼠影響胚胎早期體軸的延伸相吻合。2010年Koop等[6]在對脊椎動物原腸胚期維甲酸通路的靶基因篩選過程中發現：wnt3是維甲酸通路的間接受體，維甲酸高表達可直接上調wnt3的表達水平。在本研究中，wnt3在維甲酸致腭裂組的各個階段的表達均高于正常對照組，證實了在維甲酸誘導腭裂發生過程中，wnt3同樣是維甲酸通路的間接受體，并可直接參與腭裂的形成。

維甲酸-合成酶視黃醛脫氫酶2（RA-synthesizing enzyme retinaldehyde dehydrogenase 2，Raldh 2）功能是調控維甲酸的合成，Raldh 2基因敲除鼠胚表現為維甲酸產生不足及維生素A嚴重缺乏。研究[7]發現：wnt8a在Raldh 2基因敲除鼠胚的體軸發育中發生異位表達，且表達水平下調。雖然wnt8a基因敲除小鼠沒有觀察到明顯的腭發育異常[8]，但本研究結果表明wnt8a在正常腭發育過程中呈波動性高表達，在RA誘導的腭裂小鼠腭突中wnt8a基因表達明顯下調，提示作為wnt/β-Catenin經典通路配體的wnt8a可能參與了維甲酸誘導的腭裂發生。

fgf9與fgf10雖分屬FGF家族的不同亞族，但在小鼠胚胎頜面部發育早期，fgf9與fgf10重疊表達于鼻突及面中部[9]。fgf10在腭突發育早期表達在鄰近正中嵴和口腔面上皮下方的間充質中，fgf10基因敲除后胚胎發生明顯的腭裂，表現為腭突上皮層薄且有明顯的抑制，表明了fgf10在腭早期發育中具有調控細胞增殖和細胞存活的功能[10]。實驗組中fgf10的表達水平在腭突發育各階段均高于對照組，說明了RA通路可上調fgf10的表達水平。fgf9與腭裂發生相關的研究未見報道，但fgf9在ED14.5腭皺襞基板的上皮中有微弱的表達[11]，fgf9基因敲除小鼠肺發育研究證明了fgf9是調節fgf10表達水平的調節器[12]。在本研究維甲酸誘導腭裂組中，fgf9的表達水平在腭突上皮間充質相互作用的關鍵時期出現異常的波動，上調至最高峰；fgf10與fgf9在同一時間點表達水平上調至最高峰，提示了fgf9和fgf10在維甲酸誘導腭裂過程中也存在著調控作用。

綜上所述，在正常腭突發育的不同階段，wnt3、wnt8a、fgf9和fgf10呈現持續性動態高表達，表明上述信號分子直接參與腭的發育。而在維甲酸誘導腭裂發生的不同階段，wnt3、wnt8a、fgf9和fgf10的異常表達，提示維甲酸通路與wnt和FGF信號分子通路存在著相互作用。

[1] 王如,劉彬,王博,等.腭發育不同時期維甲酸對腭突細胞增殖和凋亡的影響[J].華西口腔醫學雜志,2008,26（5）：546-549.

WANG Ru,LIU Bin,WANG Bo,et al.Spatial and temporal changes of palatal cell proliferation and cell apoptosis of retinoic acid induced mouse cleft palate in different embryonic stages[J]. West China J Stomatol,2008,26（5）：546-549.

[2] van Amerongen R,Nusse R.Towards an integrated view of Wnt signaling in development[J].Development,2009,136（19）：3205-3214.

[3] Nie X,Luukko K,Kettunen P.FGF signalling in craniofacial development and developmental disorders[J].Oral Dis,2006,12（2）：102-111.

[4] Niemann S,Zhao C,Pascu F,et al.Homozygous WNT3 mutation causes tetra-amelia in a large consanguineous family[J].Am J Hum Genet,2004,74（3）：558-563.

[5] Liu P,Wakamiya M,Shea MJ,et al.Requirement for Wnt3 in vertebrate axis formation[J].Nat Genet,1999,22（4）：361-365.

[6] Koop D,Holland ND,Sémon M,et al.Retinoic acid signaling targets Hox genes during the amphioxus gastrula stage:Insights into early anterior-posterior patterning of the chordate body plan [J].Dev Biol,2010,338（1）：98-106.

[7] Zhao X,Duester G.Effect of retinoic acid signaling on Wnt/beta-catenin and FGF signaling during body axis extension[J].Gene Expr Patterns,2009,9（6）：430-435.

[8] van Amerongen R,Berns A.Knockout mouse models to study Wnt signal transduction[J].Trends Genet,2006,22（12）：678-689.

[9] Bachler M,Neubüser A.Expression of members of the Fgf family and their receptors during midfacial development[J].Mech Dev,2001,100（2）：313-316.

[10]Rice R,Spencer-Dene B,Connor EC,et al.Disruption of Fgf10/ Fgfr2b-coordinated epithelial-mesenchymal interactions causes cleft palate[J].J Clin Invest,2004,113（12）：1692-1700.

[11] Porntaveetus T,Oommen S,Sharpe PT,et al.Expression of Fgf signalling pathway related genes during palatal rugae development in the mouse[J].Gene Expr Patterns,2010,10（4/5）：193-198.

[12] Colvin JS,White AC,Pratt SJ,et al.Lung hypoplasia and neonatal death in Fgf9-null mice identify this gene as an essential regulator of lung mesenchyme[J].Development,2001,128（11）：2095-2106.

（本文編輯 湯亞玲）

Dynamic expression ofwnt and fibroblast growth factor ligands in cleft palate induced by retinoic acid

SHEN Lu1,CONG Wei1,WANG Ru2,XIAO Jing1.（1.Dept.of Oral Biology,College of Stomatology,Dalian Medical University,Dalian116044,China;2.Dept.of Stomatology,The First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian116011,China）

ObjectiveTo screen the wnt and fibroblast growth factor（FGF）ligands involved in palatogenesis and cleft palate,and to study the dynamic expression of them in the different stages of palatal development and cleft palate formation.MethodsMouse model of retinoic acid（RA）-induced cleft palate was set up.At embryo day（ED）14.5,the palatal tissues of RA-treated group and wild type were collected and prepared for gene-chip analysis.According to the gene-chip results,wnt3,wnt8a,fgf9 and fgf10 were selected and their expression level was detected at ED13.5-15.5 by using semi-quantitative reverse transcription-PCR（RT-PCR）.Results 1）Gene-chip analysis showed that in RA-induced cleft palate group wnt8a and fgf9 were down-regulated,wnt3 and fgf10 were up-regulated in conversely.2）During the different stage of the control group palatogenesis,intense expression of wnt3,wnt8a,fgf9 and fgf10 were detected with a continuous dynamic pattern.3）Compared with the control group,the expression level of wnt3,wnt8a,fgf9 and fgf10 in RA-induced cleft palate showed significant difference,respectively（P＜0.05）.Conclusionwnt and FGF signaling molecules participate in the palatogenesis,and RA pathway may interact with wnt and FGF signaling pathway.

cleft palate； animal model； signaling pathway； gene screen

R 782.2

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.01.015

1000－1182（2011）01－0062-04

2010-04-10；

2010-06-20

國家自然科學基金資助項目（30871352和30973349）

沈璐（1983—），女，遼寧人，碩士

肖晶，Tel：0411-86110400