姜黃素對口腔舌癌細胞增殖與轉移能力影響的實驗研究

陳教文 湯亞玲 劉紅 朱志宇 呂迪 耿寧 陳宇

（口腔疾病研究國家重點實驗室，四川大學，成都 610041）

姜黃素對口腔舌癌細胞增殖與轉移能力影響的實驗研究

陳教文 湯亞玲 劉紅 朱志宇 呂迪 耿寧 陳宇

（口腔疾病研究國家重點實驗室，四川大學，成都 610041）

目的 探討姜黃素對口腔舌癌細胞增殖與轉移能力的作用及其作用機制。方法 分別以0、5、10、20、30、60、100μmol·L-1姜黃素處理人舌癌細胞SCC-4 24 h，采用MTT法、侵襲實驗、流式細胞儀、免疫熒光顯微鏡分別檢測姜黃素對口腔舌癌細胞增殖與轉移能力的影響。然后，采用cDNA微陳列芯片技術篩選和實時定量RTPCR驗證姜黃素所調控的相關基因。結果 MTT法檢測顯示：超過20μmol·L-1濃度時姜黃素明顯地抑制細胞增殖。侵襲實驗顯示：姜黃素在20、30、60μmol·L-1時對SCC-4癌細胞的侵襲有明顯抑制作用。流式細胞儀分析顯示：姜黃素在20、30、60μmol·L-1的劑量下對細胞周期的分布有顯著的作用，熒光顯微鏡觀察，姜黃素（30μmol·L-1）會造成SCC-4癌細胞的細胞支架中的alpha-tubulin產生聚集的現象。cDNA微陳列芯片分析顯示：87個基因可被姜黃素誘導增加；198個基因受姜黃素抑制。結論 姜黃素抑制口腔舌癌的增殖和轉移，其機制可能是使cdc27、EGFR substrate 15、PPAR-alpha和H2A histone基因表達水平降低，從而使細胞停留在細胞周期的M期，達到抗舌癌細胞增殖的作用。

舌癌； 姜黃素； 增殖； 轉移

舌癌（tongue cancer）是口腔常見的惡性腫瘤之 一[1]，初期癥狀不明顯，大部分患部在診斷時可能已經發生浸潤或轉移。因此，疾病的治療和預后也大受影響。癌癥的治療效果主要取決于腫瘤細胞復發或轉移的能力，而轉移能力則是判斷患者愈后的重要指標。雖然已研究出許多藥物能夠有效地控制癌細胞的生長，但至今仍無有效藥物能夠抑制癌細胞的轉移[2]。

姜黃素（curcumin）是姜黃（curcuma longa）中最重要的有效主成分之一，傳統上常用其作為食材的矯色以及矯味，近年來也常作為化妝品以及醫藥上的添加物。在傳統醫學上，姜黃味苦辛，入肝脾，功能理血中之氣，下氣破血，除風消腫，力烈于郁金；被認為有治氣脹血積，產后敗血攻心，通月經，療補損及治風寒濕痹。現代醫學研究發現，姜黃素具有抗氧化（清除自由基）、抗動脈粥樣硬化、抗癌、抗炎及抗血管新生等功能[3-4]，但就其理論及機制的研究還相當缺乏。本研究首先檢測姜黃素是否具有抑制口腔舌癌上皮細胞增殖與轉移的能力，然后，在姜黃素不會使正常細胞致死的劑量下，以cDNA微陳列芯片技術篩選出姜黃素調控的相關基因，以探討姜黃素抗癌能力的機制。

1 材料和方法

1.1 主要的實驗材料和儀器

姜黃素（Sigma公司，美國）采用高效液相色譜法從姜黃中提取，相對分子質量為368.38，分子式為[HOC6H3（OCH3）CH=CHCO]2CH2。用10mmol·L-1DMSO液配置成0、5、10、20、30、60、100μmol·L-1，備用。cDNA微陳列芯片以及人舌癌細胞SCC-4（中國臺灣國立大學提供）。

1.2 姜黃素對人舌癌細胞增殖和侵襲作用的影響

1.2.1 細胞培養 將SCC-4置于DMEM培養液中培養，然后每3 d傳代培養。分別用0、5、10、20、30、60、100μmol·L-1的姜黃素處理細胞24 h，以作下面的檢測。

1.2.2 細胞存活率檢測 采用MTT法檢測細胞存活率。

1.2.3 侵襲實驗 采用Matrigel侵襲實驗檢測經過不同劑量姜黃素處理過的SCC-4癌細胞侵襲能力的差異。

1.2.4 流式細胞儀分析細胞周期 細胞經藥物處理后，70%乙醇固定，以碘化丙啶（propidium iodide，PI）染細胞核，上機檢測細胞周期。以細胞在G0/G1、S和G2/M期的比例來測量細胞周期。

1.2.5 免疫熒光染色法 先將SCC-4細胞在載玻片上培養，經藥物處理后，70%乙醇和甲醇將細胞固定，以triton-X 100及皂甙處理增加細胞膜通透性。然后以3%BSA阻斷，30 min后將玻片和alphatubulin的一抗反應（濃度1∶100），再將玻片和帶有FITC的二級抗體（濃度1∶500）反應。以不加一抗細胞作為陰性對照。最后用PI將細胞核染色，并觀察細胞周期。

1.3 基因芯片微陳列分析篩選差異基因

從不同劑量姜黃素處理過的癌細胞中萃取出RNA并分離之，并將其反轉錄為cDNA。再對所反轉錄的cDNA與制備好的探針進行雜交，并以酵素呈色，測量芯片上各探針位置的表現量。最后經過掃描以擷取呈色影像。搭配GenePix 3.0軟件將所得影像數據轉成數值資料。再用SPSS 13.0統計軟件做統計分析進行基因篩選。

1.4 驗證基因芯片微陳列分析篩選出的差異基因

利用實時定量RT-PCR驗證差異基因mRNA的表現量。以Primer express軟件設計待測基因引物，再以SYBR Green PCR master mix標定cDNA而后以ABI 7700 Sequence Detection System進行反應。以驗證在RNA層次上，微數組分析結果的正確與否。

2 結果

2.1 姜黃素具有抑制人舌癌細胞增殖與侵襲的能力

分別以0、5、10、20、30、60、100μmol·L-1姜黃素處理SCC-4癌細胞24 h，MTT法檢測顯示：超過20μmol·L-1濃度，姜黃素明顯地抑制細胞增殖；其50%抑制有效濃度為30μmol·L-1，在此濃度下，不會對正常細胞造成明顯的毒性作用（圖1），但在100μmol·L-1的姜黃素處理下，則對正常細胞有明顯的毒性作用。進一步以Matrigel侵襲實驗觀察癌細胞侵襲能力的改變。結果顯示：姜黃素在20、30、60μmol·L-1時對SCC-4癌細胞的侵襲有明顯抑制作用（圖2）。

圖1 在不同濃度姜黃素的作用下SCC-4細胞的增殖活性Fig 1 Cell proliferation of SCC-4 cells in different doses of curcumin

流式細胞儀分析SCC-4癌細胞的細胞周期結果顯示：姜黃素在較低劑量（5、10μmol·L-1）對細胞周期的影響不顯著；然而，在20、30、60μmol·L-1的劑量下姜黃素對細胞周期的分布有顯著的作用。初步的研究發現姜黃素能讓細胞周期停留在G2/M期（圖3）。進一步用熒光顯微鏡觀察細胞經姜黃素處理后是否有細胞周期停頓的現象。結果顯示：姜黃素（30μmol·L-1）會造成SCC-4癌細胞的細胞支架中的alpha-tubulin產生聚集的現象，這會造成細胞分裂產生障礙，因而造成細胞周期停頓（圖4）。因此，課題組以能夠抑制SCC-4癌細胞增殖與侵襲的而且不會對正常細胞造成明顯的毒性作用的有效濃度（30μmol·L-1和60μmol·L-1）來進行基因芯片微陳列分析。

圖2 在不同濃度姜黃素的作用下SCC-4細胞的侵襲能力Fig 2 Cell invasion of SCC-4 cells in different doses of curcumin

圖3 在不同濃度姜黃素的作用下SCC-4細胞的周期Fig 3 Cell cycle of SCC-4 cells in different doses of curcumin

圖4 姜黃素（30μmol·L-1）使SCC-4癌細胞的細胞支架中的alphatubulin產生聚集的現象 熒光顯微鏡 ×400Fig 4 The immunostaining indicated that alpha-tubulin was accumulated and might be aggregated in cell nuclus following curcumin treatment（30μmol·L-1） fluorescence microscope ×400

2.2 基因芯片微陳列分析差異基因頻譜

從前期的實驗中挑選2個濃度30μmol·L-1和 60μmol·L-1來做微陳列分析。結果顯示：有87個基因可被姜黃素誘導增加；相比之下，有198個基因的表現受姜黃素抑制。這些受調控的基因，包括有調控細胞周期、細胞表面抗原、細胞附著性蛋白、DNA合成、修復，重組蛋白質、生長因子、細胞因子、激素受體，細胞內信息傳導調節因子、離子通道，與代謝途徑相關的蛋白、細胞凋亡相關基因、引發炎癥反應的蛋白、胞外基質蛋白質及EST（expressed sequence tags）基因。

2.3 實時定量RT-PCR驗證cDNA微陳列分析結果

從cDNA微陳列分析的數據中發現，一些受姜黃素調控的基因，可能與其抑制癌細胞生長或與轉移相關。于是從中選取其中10個基因（包括：cdc27、crystalline beta1、crystalline gamma、EGFR substrate 15、H2A histone、neurnal pentaxin、PG-EP synthase 2、PPAR-alpha、stromelysin-3和trypsinase IA），進一步采用實時定量RT-PCR來驗證其在RNA水平上的表達，測其基因表現是否符合cDNA微陳列分析的結果。結果顯示，實時定量RT-PCR和微陳列分析的結果相符，這同時也說明這些與癌細胞生長轉移相關的基因受到了姜黃素的調控。

3 討論

舌癌是口腔常見惡性腫瘤之一，易復發或/和發生轉移，而且舌癌的初期臨床癥狀多不明顯，大部分患者在診斷時都可能已經發生浸潤或轉移。本課題組前期研究[5-6]表明：姜黃素具有預防及治療口腔癌的潛力。本研究發現：姜黃素能降低SCC-4舌癌細胞的生長與侵襲能力，且此作用具有藥物劑量相關性。經過cDNA微陳列分析后也發現：姜黃素抗舌癌細胞的增殖與侵襲的可能機制，為今后研究更多的抗癌藥物提供實驗依據。

實驗研究表明：姜黃素可以抑制老鼠巴豆酯誘導的皮膚腫瘤。在倉鼠的動物實驗[7]中亦發現：二甲基苯并蒽所引起的口腔上皮細胞癌變被姜黃素抑制。過去研究已顯示：姜黃素除了具有抗癌細胞增殖的效果，也具有抑制轉移的能力[6]：濃度低于每千克體重200 nmol的姜黃素在人體內具有顯著抑制癌細胞轉移的能力，且證實其能減少80%肺腫瘤，提高患者的存活時間；在黑色素腫瘤細胞B16F-10中，以27.14μmol·L-1濃度姜黃素處理，具有顯著抑制其侵襲Boyden小室基質的能力[4]；在老鼠的實驗中，發現其具有抑制血管新生的能力[4]。盡管癌轉移研究報告相當多，但整個癌轉移的機制相當復雜，目前的研究仍無法完全明了。因此分析癌細胞轉移的相關基因，進而了解癌轉移的機制仍然是目前癌癥研究的重要課題。以往的研究[4-7]表明：姜黃素的作用機制主要是影響信號轉錄的因子達到上述的功能。姜黃素也具有抑制細胞周期的功能，并能通過調節c-myc、bcl-2來誘導細胞凋亡的產生。在肺癌細胞中的研究指出，姜黃素抗肺癌主要是使NCAM、TOPO-I、TOPO-II、AXL tyrosinase表達降低，并抑制NF-kappa B轉錄活性，從而抑制癌細胞的增殖與轉移，以往在口腔癌的相關研究[3-4]中發現：姜黃素的抗癌機制可能受多因素的調控，其中包括抗細胞增殖、抑制血管新生、抗氧化作用等。其調控的機制除了通過使轉錄因子表達下降來達到抗癌效果，還可以抑制酪氨酸激酶受體的活性[4]。

本研究以基因微陳列芯片和定量RT-PCR的技術證明，姜黃素可能通過調控一些與細胞增殖和轉移相關的基因（cdc27、crystalline beta1、crystalline gamma、EGFR substrate 15、H2A histone、neurnal pentaxin、PG-EP synthase 2、 PPAR-alpha、stromelysin-3和trypsinase IA）來達到抗癌效果。在這些受姜黃素調控的基因中，cdc27、EGFR substrate 15、PPAR-alpha和H2A histone與細胞生長息息相關，cdc27主要位于細胞中心體附近，具有增殖細胞核抗原依賴聚合酶活性，將細胞中的cdc27去除會造成細胞生長停止在細胞周期的分裂期，這與本研究觀察到姜黃素會使SCC-4舌癌細胞停滯在G2/M期的結果是相符合的。近年來的研究[8]指出：H2A histone的磷酸化參與了細胞周期的M期，并與細胞分裂過程中染色體相關。其他研究[9]也顯示：PPARalpha、crystalline、pentaxin與stromelysin-3等都參與了細胞在G2/M期中細胞周期，并發現這些因子與一些癌癥有著密切的關系。本實驗顯示：這些基因受姜黃素的抑制，表明可能與姜黃素對口腔舌癌的抗癌作用有關。此外，一些參與細胞移動（包括細胞內骨架和細胞外蛋白水解酵素）相關的基因stromelysin-3、pentaxin和trypsinase IA也會被姜黃素所抑制。其中，stromelysin-3又稱為基質金屬蛋白酶-11（matrix metalloproteinase-11，MMP-11），其為癌細胞分泌的能降解癌細胞附近的基質蛋白，有助于癌細胞轉移的重要分子；MMP-11與其他的MMP家族（至少包括MMP-2、-7、-9、-10）發現與癌癥生成和預后相關；目前被視為治療癌癥和阻止癌細胞擴散轉移的新藥治療目標[10]。

姜黃素抑制口腔舌癌的機制可能是使cdc27、EGFR substrate 15、PPAR-alpha和H2A histone表達水平降低，從而使細胞停留在細胞周期的M期，從而達到抗舌癌細胞增殖的作用；此外，姜黃素也會通過抑制MMP-11、pentaxin和trypsinase IA基因表達水平，從而抑制癌細胞的侵襲能力，達到抗轉移的作用，但舌癌發生及轉移的機制是相當復雜的，是多基因參與多步驟的過程，還需不斷深入廣泛地研究。希望此研究對研究開發抗口腔癌新藥有一定的意義，以基因芯片進行藥物作用機制研究，并建立藥物篩選平臺，可作為今后研究其他中草藥抗癌作用的參考。

[1] Schleuning AJ 2nd,Summers GW.Carcinoma of the tongue：Review of 220 cases[J].Laryngoscope,1972,82（8）：1446-1454.

[2] Bagan J,Sarrion G,Jimenez Y.Oral cancer：Clinical features[J]. Oral Oncol,2010,46（6）：414-417.

[3] Aggarwal BB,Kumar A,Bharti AC.Anticancer potential of curcumin：Preclinical and clinical studies[J].Anticancer Res,2003, 23（1A）：363-398.

[4] Bar-Sela G,Epelbaum R,Schaffer M.Curcumin as an anticancer agent：Review of the gap between basic and clinical applications [J].Curr Med Chem,2010,17（3）：190-197.

[5] Li N,Chen X,Liao J,et al.Inhibition of 7,12-dimethylbenz[a] anthracene（DMBA）-induced oral carcinogenesis in hamsters by tea and curcumin[J].Carcinogenesis,2002,23（8）：1307-1313.

[6] Lin YC,Chen HW,Kuo YC,et al.Therapeutic efficacy evaluation of curcumin on human oral squamous cell carcinoma xenograft using multimodalities of molecular imaging[J].Am J Chin Med,2010,38（2）：343-358.

[7] Huang MT,Newmark HL,Frenkel K.Inhibitory effects of curcumin on tumorigenesis in mice[J].J Cell Biochem Suppl,1997,27：26-34.

[8] Ichijima Y,Sakasai R,Okita N,et al.Phosphorylation of histone H2AX at M phase in human cells without DNA damage response [J].Biochem Biophys Res Commun,2005,336（3）：807-812.

[9] Schweitzer A,Knauer SK,Stauber RH.Nuclear receptors in head and neck cancer：Current knowledge and perspectives[J].Int J Cancer,2010,126（4）：801-809.

[10]Kessenbrock K,Plaks V,Werb Z.Matrix metalloproteinases：Regulators of the tumor microenvironment[J].Cell,2010,141（1）：52-67.

（本文編輯 胡興戎）

Anti-proliferative and anti-metastatic effects of curcum in on oral cancer cells

CHEN Jiao-wen,TANG Yaling,LIU Hong,ZHU Zhi-yu,LüDi,GENG Ning,CHEN Yu.（State Key Laboratory of Oral Diseases,Sichuan University,Chengdu610041,China）

ObjectiveThe purpose of this article is to examine the effect of curcumin on the proliferation and metastasis of human tongue squamous cell carcinoma and analyze its mechanism.MethodsSCC-4 were treated with curcumin of 0,5,10,20,30,60,100μmol·L-1in 24 h.MTT assay,Matrigel invasion assay,flow cytometry and fluorescence microscopy were used to examine the effect of curcumin on the growth and metastasis of SCC-4.cDNA microarray and RT-PCR were employed to analyze the expression of genes treated by curcumin.Results The results showed that curcumin could concentration-dependently inhibit SCC-4 cell proliferation at the concentration range from 20 to 100μmol·L-1.Furthermore,Matrigel invasion assay indicated that curcumin can reduce SCC-4 cell invasion under the dosage of 20,30,60μmol·L-1.Flow cytometry also showed that curcumin can influence the distribution of cell cycle of SCC-4 cell with the dosage of 20,30,60μmol·L-1.And the dosage of 30μmol·L-1curcumin could lead to the recruitment of alpha-tubulin.cDNA microarray showed that 87 genes were activated and 198 genes were inhibited with the effect of curcumin.These results were validated by the real time quantitative RT-PCR.ConclusionAccording to the results,it suggests that curcumin has the potential as the leading compound for anti-cancer proliferation and invasion in oral cancer treatment,and cdc27,EGFR substrate 15,PPAR-alpha and H2A histone may play an important role among this multiple anticancer-targeting ability.

tongue cancer； curcumin； proliferation； metastasis

R 739.86

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.01.020

1000－1182（2011）01－0083-04

2010-09-10；

2010-11-20

高等學校博士點學科專項科研基金資助項目（20090181-110059）

陳教文（1969—），男，2007級臺灣籍博士研究生

陳宇，Tel：028-85501465