大鼠實驗性牙移動中配基門控陽離子通道P2X3受體在牙髓中的表達變化

盧云 楊秩 華小川 常新 貴林 王晟 賴文莉

（1.大連醫科大學口腔醫學院 正畸教研室，大連 116044；2.四川大學華西口腔醫院 正畸科，成都 610041；3.上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院 正頜正畸聯合治療中心，上海 200011；4.云南省第二人民醫院 口腔正畸科，昆明 650021）

大鼠實驗性牙移動中配基門控陽離子通道P2X3受體在牙髓中的表達變化

盧云1，2楊秩3華小川4常新1貴林1王晟2賴文莉2

（1.大連醫科大學口腔醫學院 正畸教研室，大連 116044；2.四川大學華西口腔醫院 正畸科，成都 610041；3.上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院 正頜正畸聯合治療中心，上海 200011；4.云南省第二人民醫院 口腔正畸科，昆明 650021）

目的 探討大鼠實驗性牙移動過程中配基門控陽離子通道P2X3受體在牙髓中表達變化，初步了解P2X3受體在正畸牙移動過程中的可能作用。方法 將54只雄性SD大鼠（體重200～250 g）隨機分為空白組（5只）、對照組（14只）和實驗組（35只）。選擇左側上頜第一磨牙作為觀察對象，獲取不同時間點牙髓組織切片，進行免疫組織化學研究。結果 正畸牙移動加力后，牙髓中P2X3受體免疫陽性表達增加，并呈現一定的時間規律：即受力后1/6 d逐漸增加，3 d達到高峰，7 d后下降至加力前水平。結論 正畸牙移動疼痛信息傳遞過程中P2X3受體呈現有規律變化，推測P2X3受體與牙移動傷害表達密切相關，但其作用機制還有待進一步研究。

實驗性牙移動； 牙髓； 疼痛； P2X3受體

研究證實三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）是線粒體氧化磷酸化的產物，是組織中傷害性刺激（包括疼痛）傳導的重要神經遞質。ATP與其配基門控陽離子通道P2X3受體結合后傳遞疼痛信息。P2X3受體是嘌呤受體P2X大家族的一員，可特異地在與C類傳入纖維相連的神經元上表達[1]。目前已有較多的動物實驗證明支持P2X3受體介導傷害感受的理論，其中通過對P2X3受體基因敲除的大鼠實驗已經比較明確了P2X3受體在大鼠的外周疼痛傳入中的主要作用[2]。實驗性牙移動可引起牙髓內神經纖維密度及分布的改變[3]，目前國內外尚未見實驗性牙移動后P2X3受體在牙髓表達變化的研究報道，本研究主要目的在于探索正畸牙移動加力后P2X3受體在牙髓中的表達變化規律，并與外周神經三叉神經節（trigeminal ganglion，TG）和中樞神經三叉神經脊束核尾側亞核淺層（trigeminal subnucleus caudalis，TSC）進行比較，從而為研究P2X3受體在正畸疼痛機制中的作用奠定堅實的基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和分組

選用8周齡雄性SD大鼠54只，體重200～250 g（由四川大學華西動物中心提供），隨機分組飼養在玻璃箱中，給予晝夜生物節律飼養。

分為空白組（5只）、對照組（14只）、實驗組（35只）。對照組和實驗組又各分為1/6、1/2、1、2、3、5、7 d共7組。

1.2 實驗模型的建立和標本的制備

空白組的大鼠直接處死。其他組大鼠從腹部注射10%水合氯醛注射液（3mL·kg-1）。實驗組大鼠在左側上頜安放加力裝置，將直徑為0.25mm的不銹鋼結扎絲穿過大鼠左側上頜第一磨牙與第二磨牙鄰間隙后，將鎳鈦拉簧置于左側上頜第一磨牙與同側切牙之間，力值0.39 N，使磨牙產生近中傾斜移動，于各時間點處死各組大鼠。對照組大鼠進行與實驗組相同的實驗過程但不加力，處理后與實驗組相同時間點處死。迅速取出處死大鼠左上頜第一磨牙的牙齒及其牙周組織，固定，漂洗，放入0.5molEDTA中脫鈣1個月，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，沿大鼠第一磨牙遠中腭根行縱向連續切片，5μm厚，備做蘇木精-伊紅染色、免疫組織化學染色之用。

1.3 SP免疫組織化學分析法

梯度脫水，用3%的過氧化氫溶液處理切片，0.01mol PBS沖洗，0.1%胰酶修復，0.01mol PBS沖洗，滴入親和純化的P2X3兔抗鼠多克隆抗體（1∶300）約50μL于組織上，置于37℃濕盒中孵育60min后于4℃冰箱過夜，0.01mol PBS沖洗；加入第二抗體生物素化羊抗兔IgG（1∶200）滴在組織上，37℃濕盒中孵育60min；0.01mol PBS沖洗，加入辣根酶標記白素三抗，37℃濕盒中孵育60min；0.01mol PBS沖洗，DAB染色。

1.4 圖像分析

采用Olympus光學顯微鏡進行組織學觀察和陽性表達統計。每只大鼠選1張切片，每張切片在左上頜第一磨牙牙髓選擇3個區域，在高倍鏡下（×400）進行分析，用尼康E600研究顯微鏡SPOT COD CCD攝像頭進行圖像采集，選用Image-Pro Plus計數P2X3受體免疫陽性的光密度值，以3次測量值的均值作為該動物在該時間段的實測值。

1.5 統計學處理

圖像分析結果采用SPSS 13.0軟件進行分析牙髓中空白組、對照組及實驗組之間的方差分析和兩兩比較，兩兩比較采用LSD法，比較3個組P2X3受體表達是否有差異。

2 結果

2.1 正常大鼠牙髓的解剖結構

牙髓組織是由細胞、纖維和基質構成的一種疏松結締組織，負擔牙齒的營養、代謝、感覺和修復等功能，是牙體組織中唯一的軟組織，正常大鼠牙髓的解剖結構見圖1。

圖1 大鼠牙髓形態Fig 1 Morphous of rat pulp

2.2 牙髓中P2X3受體的表達變化

牙髓中P2X3受體表達的免疫組織化學染色顯示：P2X3受體陽性表達為棕褐色，空白組及對照組大鼠牙髓組織中P2X3受體表達弱陽性，主要位于成牙本質細胞層神經叢，伸向前期牙本質和牙本質，冠髓和根髓中均有表達（圖2）。正畸加力后P2X3受體表達顯著增強，具體變化如下。

空白組、對照組及實驗組3組方差分析，三者總體均有差別，采用LSD法進行兩兩比較。空白組與對照組比較P2X3受體陽性表達差異均無統計學意義（P＞0.05），而實驗組各時間點與空白組和對照組之間進行比較P2X3受體陽性表達差異均有統計學意義（P＜0.05）。

對照組與實驗組牙髓中各時間點P2X3受體陽性表達平均光密度值見表1，2組相同時間點進行t檢驗分析，顯示二者之間差異無統計學意義，表明實驗中對大鼠的處理（麻醉、穿引結扎絲等）對實驗結果并無影響（P＞0.05）。

不同組牙髓中P2X3受體陽性表達變化見圖3。在大鼠牙加力移動后的1/6 d至7 d，實驗組P2X3受體免疫陽性表達比對照組有明顯升高，呈現短時上調變化并有一定時間規律：即受力后1/6 d逐漸增加，3 d達到高峰，7 d后下降至加力前水平。

表1 不同組不同時間點牙髓中P2X3受體染色光密度值Tab 1 P2X3 receptor staining optical density value at different experimental time in different groups ±s

表1 不同組不同時間點牙髓中P2X3受體染色光密度值Tab 1 P2X3 receptor staining optical density value at different experimental time in different groups ±s

注：*P<0.05。

時間/d 空白組 對照組 實驗組0 63 994.00±4 820.861 1/6 85 955.50±4 434.267 115 214.75±16 382.637* 1/2 60 792.00±8 995.812 157 738.00±46 705.536* 1 74 791.50±7 592.615 182 315.75±13 041.310* 2 62 435.00±3 964.041 215 673.75±15 211.197* 3 73 194.00±8 677.614 262 182.00±66 521.402* 5 61 957.00±4 712.160 164 793.75±22 691.308* 7 60 963.00±11 853.938 127 969.50±16 675.129*

圖3 不同組牙髓中P2X3受體陽性表達時間變化Fig 3 P2X3 receptor-positive expression in dental pulp at different experimental time in different groups

3討論

P2X3受體是神經遞質或神經調質ATP調控的配基門控陽離子通道，可獨立或者聯合在傷害感受器感覺神經節的中小直徑神經元如背根神經節（dorsal root ganglion，DRG）、TG及節狀神經節（nodose ganglion，NG）中高表達，另外在交感神經節中亦有少量表達[4]。P2X3受體的這種顯著的選擇性表達提示它可能在ATP激活的傷害性感受活動中起傳感器的作用[5]。P2X3受體不僅在初級傳入神經元的胞體有功能性表達，而且這些受體能雙向轉運到中樞和外周神經。

在正畸力作用下，牙周膜、牙槽骨和牙齦等會發生組織相應變化，即使輕微的力量也將對神經有激惹并造成一定的神經損傷，從而導致患者出現疼痛不適等感覺異常。牙髓組織有豐富的神經支配，其感覺神經來源于三叉神經。Jiang等[6]研究證實：大鼠磨牙在根髓和冠髓處均見P2X3受體免疫陽性纖維存在，其形成成牙本質細胞下層神經叢，且伸向前期牙本質和牙本質。在人的第三磨牙牙髓內亦見P2X3受體的存在和分布，在Raschkow成牙本質細胞叢下以及成牙本質細胞區的大部分纖維P2X3呈免疫反應陽性[7]，且人與大鼠P2X3受體亞基有93%的同源性。本研究與以往研究結果類似，P2X3受體免疫陽性纖維主要分布于成牙本質細胞層，冠髓和根髓中均有表達。

組織受損時導致ATP釋放，與P2X3受體結合后引起P2X3受體陽性感覺神經元的去極化，從而激活了傷害感受器。本實驗顯示實驗性牙移動過程中大鼠牙髓P2X3受體免疫陽性表達呈現上調趨勢，即實驗組受力后1/6 d逐漸增加，實驗后3 d時達到高峰，至7 d下降到加力前水平，提示牙移動時造成了一定的神經激惹，矯治力使牙齒一側神經受壓另一側受牽張，激惹導致ATP的釋放，激活傷害感受器，而P2X3受體這個特殊的離子通道貫穿于神經元胞膜內外，當ATP在細胞外部與其結合時就開放，從而激活了牙髓部分未表達或表達較弱的細胞，P2X3受體陽性表達增加。

本實驗結果及以前的神經損傷的報道均發現：P2X3受體的表達在1周或者2周后出現降低，這可能是局部組織已經逐漸適應外界刺激的緣故，也說明P2X3受體的表達變化可隨刺激而變化，是短時間的效應，不是一個持續的變化，也符合了牙移動的一過性疼痛規律，提示P2X3受體在牙移動疼痛中的重要作用。在以往對人正畸牙移動疼痛的研究中發現[8]：放置弓絲后4 h疼痛開始增加，并且在1/2 d已達到峰值，3 d后開始回落，7 d后基本恢復正常。這與本實驗得出的P2X3受體陽性表達變化的規律相似。因此推測，本實驗動物模型在一定程度上模擬人正畸牙移動時傷害信息的傳遞過程，P2X3受體可能在其中有著重要作用。

在課題組以往的研究中發現實驗性正畸牙移動過程中，TG中P2X3受體表達為一過性變化，呈現短時上調的規律，時間與正畸牙移動時的疼痛時間吻合，TSC加力側的P2X3受體表達變化也呈現短時上調的規律，其與外周的表達規律基本相同，本研究發現：在受力局部牙髓中P2X3受體亦表現出類似的變化規律，因此推測P2X3受體在受力局部、外周和中樞都與牙移動傷害表達及傳遞密切相關，但其作用機制還有待進一步探索[9]。

本研究肯定了P2X3受體在正畸牙移動疼痛中的重要作用，初步探索了P2X3受體在牙髓中的表達變化，但是僅對表達進行了定性的分析，對于定量的統計及其表達的機制還有待進一步研究。在今后的研究中可以探索P2X3受體在其拮抗劑作用下表達變化的規律以及與其他疼痛介質的相互作用[10-11]，進而期待揭示P2X3受體在正畸疼痛中的扮演的角色，尋找切實有效的緩解正畸疼痛的方法。

[1] Yiangou Y,Facer P,Birch R,et al.P2X3receptor in injured human sensory neurons[J].Neuroreport,2000,11（5）：993-996.

[2] Souslova V,Cesare P,Ding Y,et al.Warm-coding deficits and aberrant inflammatory pain in mice lacking P2X3receptors[J]. Nature,2000,407（6807）：1015-1017.

[3] Vandevska-Radunovic V,Kvinnsland S,Kvinnsland IH.Effect of experimental tooth movement on nerve fibres immunoreactive to calcitonin gene-related peptide,protein gene product 9.5,and blood vessel density and distribution in rats[J].Eur J Orthod, 1997,19（5）：517-529.

[4] Xiang Z,Bo X,Burnstock G.Localization of ATP-gated P2X receptor immunoreactivity in rat sensory and sympathetic ganglia [J].Neurosci Lett,1998,256（2）：105-108.

[5] Cook SP,Vulchanova L,Hargreaves KM,et al.Distinct ATP receptors on pain-sensing and stretch-sensing neurons[J].Nature, 1997,387（6632）：505-508.

[6] Jiang J,Gu J.Expression of adenosine triphosphate P2X3receptors in rat molar pulp and trigeminal ganglia[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod,2002,94（5）：622-666.

[7] Alavi AM,Dubyak GR,Burnstock G.Immunohistochemical evidence for ATP receptors in human dental pulp[J].J Dent Res, 2001,80（2）：476-483.

[8] 羅薇,楊秩,賴文莉.視覺模擬評分法評價多個臨床因素對正畸初始疼痛的影響[J].實用口腔醫學雜志,2007,23（6）：867-870.

LUO Wei,YANG Zhi,LAIWen-li.Evaluating of clinical factors related to initial pain of orthodontic treatment by visual analogue scales（VAS）[J].J Pract Stomatol,2007,23（6）：867-870.

[9] 曹陽,賴文莉,陳揚熙.實驗性牙移動中三叉神經節P2X3受體蛋白量及mRNA的表達變化[J].華西口腔醫學雜志,2006,24（5）：389-392.

CAO Yang,LAIWen-li,CHEN Yang-xi.Differential regulation of P2X3protein expression in the rat trigeminal ganglion after experimental tooth movement[J].West China J Stomatol,2006, 24（5）：389-392.

[10]Wu G,Whiteside GT,Lee G,et al.A-317491,a selective P2X3/ P2X2/3 receptor antagonist,reverses inflammatory mechanical hyperalgesia through action at peripheral receptors in rats[J].Eur J Pharmacol,2004,504（1/2）：45-53.

[11] Taylor AM,Peleshok JC,Ribeiro-da-Silva A.Distribution of P2X（3）-immunoreactive fibers in hairy and glabrous skin of the rat[J].J Comp Neurol,2009,514（6）：555-566.

（本文編輯 湯亞玲）

Expression of ligand-gated cation channels P2X3receptor in rat pulp during experimental tooth movement

LU Yun1，2,YANG Zhi3,HUA Xiao-chuan4,CHANG Xin1,GUI Lin1,WANG Sheng2,LAIWen-li2.（1.Dept.of Orthodontics,College of Stomatology,Dalian Medical University,Dalian116044,China;2.Dept.of Orthodontics,West China College of Stomatology,Sichuan University,Chengdu610041,China;3.Joint Orthodontics-Orthognathic Surgery Center,The Ninth People’s Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai200011,China; 4.Dept.of Orthodontics,The Second People’s Hospital of Yunnan Province,Kunming650021,China）

ObjectiveTo investigate ligand-gated cation channels P2X3receptors changes in rat pulp during experimental tooth movement（ETM）,and preliminarily find their possible effect during ETM.Methods54 male SD rats（200-250 g）were selected and randomly divided into blank group（5 rats）,control group（14 rats）and experimental group（35 rats）.The left maxillary first molar was selected as observation object,the pulp tissue biopsies was taken at different time points to carry out immunohistochemical study.Results Predominant up regulation of P2X3receptors immunoactivity was found in pulp from 1/6 d to 7 d after experimental tooth movement.It started to significantly increase at 1/6 d,peaked at 3 d,and then decreased continuously until 7 d as compared with the beginning.ConclusionP2X3receptors have a rhythm change in rat pulp as a result of ETM,speculated that P2X3receptors is closely related to the tooth movement injury,but the mechanism of action need further researches.

experimental tooth movement； pulp； pain； P2X3receptor

R 781.4

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.02.021

1000－1182（2011）02－0183-04

2010-06-29；

2010-11-20

盧云（1982—），女，河北人，碩士

賴文莉，Tel:028-85501442