大腸埃希菌臨床株Dr粘附素的檢測及其序列分析

劉世花，劉德夢，趙慶英，宮艷格

（天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院感染性疾病研究所，天津300211）

大腸埃希菌是臨床上最常見的致病菌，致病因素復雜，而粘附素是其主要致病因素之一。其中Afa/Dr家族粘附素是大腸埃希菌的主要粘附素之一，它主要表達于腸道彌漫粘附性大腸埃希菌和尿道致病性大腸埃希菌。而Dr粘附素又是該家族粘附素中的一個重要成員，與30%～50%膀胱炎、50%兒童慢性腹瀉、30%孕婦腎盂腎炎及青年女性復發(fā)性泌尿系統(tǒng)感染密切相關，攜帶Dr粘附素的大腸埃希菌有形成慢性和復發(fā)性感染的傾向[1]。目前，我國缺乏對Afa/Dr家族粘附素的研究。本實驗通過擴增大腸埃希菌該家族粘附素的共有序列afa/draC及Dr粘附素的特異序列draE，從而了解該家族粘附素及Dr粘附素在大腸埃希菌臨床株中的攜帶情況及編碼粘附蛋白draE基因的突變情況。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 600株大腸埃希菌分離自天津市某醫(yī)院患者送檢的各種標本，剔除重復菌株，其中261株來自泌尿系感染患者的尿，244株來自急性腹瀉患者的便，22株來自呼吸道痰標本，其他73株來自其它部位(外傷分泌物、血、腹水)。

陽性對照菌株AAEC191A(pCC90)由美國華盛頓大學Steve Moseley教授惠贈。陰性對照菌株為國際通用無菌毛代表菌株E.coli K-12p678-54菌株，由英國伯明翰大學兒童保健中心Stuart Knutton教授惠贈。

1.2 主要儀器 PCR擴增儀533244249（德國Eppendorf公司）、thermo-mixer恒溫震蕩儀（德國Eppendorf公司）、離心機5415D（德國Eppendorf公司）、DYY-6D型電泳儀和水平電泳槽（北京六一儀器廠）、GELDOC-200型凝膠成像系統(tǒng)（美國BIORAD公司）

1.3 主要試劑 Premix（PerfectShotTMTaq）、DNA marker DL 2000購自大連寶生物TaKaRa生物工程公司，引物由上海生物工程公司合成，序列分別為：

兩對引物擴增的目的基因分別為Afa/Dr家族粘附素的afa/draC及draE基因片段，長度大小分別為672bp、484bp。

1.4 DNA提取 參照Pitout[2]方法提取細菌總DNA。95℃水浴加熱10min，以11000r/min速度離心10min，小心吸取上清液保存，作為PCR模板。

1.5 PCR擴增afa/draC和draE基因 反應體系：50μL，含Premix（PerfectShotTMTaq）25μL，上下游引物各2μL，DNA模板4μL，去離子水17μL。

反應條件：afa/draC：預變性94℃4min，變性94℃45s，退火53℃30s，延伸72℃1min，共30個循環(huán)，末次循環(huán)延伸72℃8min。

draE:預變性94℃4min，變性94℃30s，退火54℃30s，延伸72℃45s，共30個循環(huán)，末次循環(huán)延伸72℃8min。

PCR產物分析：取6μL PCR產物，在含0.5mg/L溴化乙啶的1%瓊脂糖凝膠中電泳30min。使用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察結果，分析PCR產物。如果出現(xiàn)特異性擴增條帶可能為陽性菌株。

1.6 DNA序列測序及分析 PCR擴增產物送上海英駿生物公司進行正負雙向DNA測序。測序結果與genebank中的標準序列進行比對，應用DNAstar軟件將draE的DNA測序結果轉化為氨基酸序列后與陽性對照株pCC90所對應的氨基酸序列進行比對分析。

2 結果

2.1 Afa/Dr家族粘附素的攜帶率 600株大腸埃希菌中402株afa/draC基因陽性，陽性率為67.0%。其中分離自尿的大腸埃希菌261株中186株陽性，陽性率71.3%；分離自便的大腸埃希菌244株中169株陽性，陽性率為69.3%；其余47株陽性菌株分別來自痰和其他分泌物。PCR擴增afa/draC基因電泳結果見圖1。

圖1 大腸埃希菌臨床株afa/draC基因片段的PCR擴增產物電泳圖Fig1 PCR amplification of afa/draC in E.coli clinical strainsM.DL2000DNA Marker;1.陽性對照;2.100;3、4、5.實驗中的陰性菌株;6. B1683;7.陰性對照;8.空白對照

2.2 draE基因的擴增及序列分析 402株攜帶Afa/Dr家族粘附素的大腸埃希菌3株經PCR檢測出現(xiàn)484bp的預期條帶，PCR擴增draE基因電泳結果見圖2。PCR產物送上海英俊生物公司進行測序。結果與genebank AF329316的基因序列進行比對，發(fā)現(xiàn)陽性對照株pCC90的該段基因序列與genebank所示完全一致；3株臨床分離株的draE基因序列與陽性對照株pCC90對比具有高度同源性（大于99%），其中分別存在1～3處堿基的缺失或插入，分別在第10、第42、第436、第475位點堿基的缺失及第7～8、第479～480位點之間堿基的插入，其詳細突變情況見表1。應用DNAstar軟件將上述DNA測序結果轉化為氨基酸序列后與陽性對照株pCC90所對應的氨基酸序列進行比對，結果顯示同源性均為100%。

圖2 大腸埃希菌臨床株draE基因片段的PCR擴增產物電泳圖Fig.2 PCR amplification of draE in E.coli clinical strains M.DL2000DNA Marker;1.陽性對照;2.100;3.321;4.B1683;5.陰性對照

表1 3個陽性菌株draE基因序列突變位點Tab 1 The mutations of draE in three positive bacterias

2.3 Dr粘附素的攜帶率 600株大腸埃希菌中3株（0.5%）攜帶draE基因，占Afa/Dr家族粘附素的0.75%。其中1株分離自泌尿道，另2株分離自消化道急性腹瀉患者的糞便。

3 討論

大腸埃希菌是目前醫(yī)院感染中最主要的病原菌之一，而抗菌藥物的廣泛使用使得細菌的耐藥日益嚴重，重癥感染者單用敏感抗生素往往不能改善病情進展。隨著人們對細菌致病機制的研究，毒力因子將成為抗感染治療的新靶位[4]。大腸埃希菌的毒力因子主要包括粘附素、毒素、外膜蛋白、鐵轉運系統(tǒng)等。其中粘附素是借助粘附激活被粘附細胞的信號傳導系統(tǒng)，使其不同程度釋放不同種類的細胞因子，導致炎性反應性損傷；而某些粘附因子與受體作用，激活細胞凋亡控制系統(tǒng)，引起細胞凋亡。炎癥損傷和細胞凋亡有利于細菌生長、繁殖和擴散。

目前發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌重要粘附素之一Afa/Dr家族粘附素包括13種亞型，基因結構主要由afa/ draA、afa/draB、afa/draC、afa/draD、afa/draE 5個基因片段組成，A～D基因片段具有相對高的保守性，而編碼粘附蛋白E基因片段具有高度的變異性。其中C基因編碼引導蛋白，與周漿蛋白一起輔助粘附蛋白到達細菌表面；E基因編碼粘附蛋白，二者是細菌粘附于細胞的關鍵結構，C基因和E基因的某些突變可以使引導蛋白或粘附蛋白的結構和功能發(fā)生改變。

本研究通過Afa/Dr家族粘附素共有序列afa/ draC及Dr粘附素的特異序列draE基因PCR檢測、序列分析，對600株大腸埃希菌臨床株該家族粘附素及Dr粘附素的攜帶率進行了分析。研究結果顯示，402株攜帶Afa/Dr家族粘附素，陽性率為67.0%；其中分離自泌尿道、消化道的大腸埃希菌afa/draC基因陽性率分別為71.3%、69.3%，說明Afa/Dr家族粘附素是泌尿道感染、急性腹瀉相關大腸埃希菌的一個主要的粘附素。在402株攜帶Afa/Dr家族粘附素的大腸埃希菌中，3株攜帶Dr粘附素，占家族粘附素的0.75%。2007年美國學者Natalia[5]對美國華盛頓某醫(yī)院的大腸埃希菌Dr粘附素的檢測發(fā)現(xiàn)其占家族粘附素的25%，遠遠高于本實驗結果，這可能是由于地區(qū)差異和實驗菌株的來源不同導致的，國外研究的實驗菌株主要分離自復發(fā)性尿路感染和慢性腎盂腎炎患者，而本實驗菌株主要分離自膀胱炎及急性腹瀉患者。以往的研究顯示Dr粘附素在尿道致病性大腸埃希菌中檢出率最高，DraE陽性的大腸埃希菌結合于分化完全的膀胱上皮細胞，而本研究中3株draE陽性的大腸埃希菌僅有1株分離自泌尿系統(tǒng)，另2株都分離自消化道，其具體作用機制及這3株菌是否具有同源性有待進一步研究。

在泌尿系感染和腹瀉的發(fā)生過程中，Dr粘附素與Ⅳ型膠原的識別起到關鍵作用，而draE基因編碼粘附蛋白通過周漿伴侶途徑分泌至細菌表面[6]，是細菌粘附于細胞的關鍵結構。點特異性突變實驗表明，DraE的第54個氨基酸必需帶有負電荷才有氯霉素敏感的受體結合特點，氨基酸序列在第32、40、54、90和113位點上突變會改變粘附素的粘附能力和氯霉素敏感特性，使得Dr粘附素不能與Ⅳ型膠原結合[7]。本實驗draE基因陽性的3株大腸埃希菌，PCR擴增后進行測序，與genebank比對顯示：與陽性對照株pCC90對比具有高度同源性，所測菌株均存在1～3個點突變，進行氨基酸比對顯示與陽性對照株pCC90的同源性均為100%。說明本實驗檢測出的陽性菌株在致病過程中Dr粘附素起著很重要的作用。

總之，Dr粘附素在尿道致病性大腸埃希菌和腹瀉相關性大腸埃希菌的致病過程中具有重要作用。目前粘附素及其受體的結構研究仍是國內外研究的熱點，本實驗為進一步研究Dr粘附素提供基礎，筆者可以進一步對DraE蛋白進行克隆表達研制相應的疫苗，從而使粘附素成為抗感染治療的新靶位，降低大腸埃希菌的致病作用。

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［5］ Natalia K.Selection for functional diversity drives accumulation of point mutations in Dr adhesins of Escherichia coli[J].Mol Microbiol,2007,64(1):180

［6］ Servin AL.Pathogenesis of Afa/Dr diffusely adhering Escherichia coli[J].Clin Microbiol Rev,2005,18(2):264

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