沉默DNA結合抑制蛋白-1基因對腺樣囊性癌細胞生長和侵襲能力的影響

劉培 張向紅 胡振生 孫善珍 劉少華 魏奉才

（1.山東大學齊魯醫院 整形外科； 2.山東大學醫學院 組織胚胎學教研室；

3.山東大學口腔醫院 病理科；4.山東大學齊魯醫院 口腔科研究室，濟南 250012）

沉默DNA結合抑制蛋白-1基因對腺樣囊性癌細胞生長和侵襲能力的影響

劉培1張向紅2胡振生1孫善珍3劉少華4魏奉才4

（1.山東大學齊魯醫院 整形外科； 2.山東大學醫學院 組織胚胎學教研室；

3.山東大學口腔醫院 病理科；4.山東大學齊魯醫院 口腔科研究室，濟南 250012）

目的 探討DNA結合抑制蛋白-1（Id-1）基因在腺樣囊性癌細胞生長和侵襲行為中的作用。方法 以涎腺腺樣囊性癌細胞系ACC-M和ACC-2為研究對象，免疫熒光檢測Id-1基因的表達；用小干擾RNA進行Id-1基因的RNA干擾；于干擾前后應用RT－PCR和Western blot檢測2個細胞系Id-1表達情況；于干擾前后應用MTT法檢測細胞的生長情況及用Transwell小室檢測細胞的侵襲能力。結果 在ACC-M和ACC-2中，Id-1均有表達，ACC-M表達量高于ACC-2；通過RNA干擾沉默Id-1基因后，ACC-M和ACC-2的生長和侵襲能力均受到抑制。在受抑制程度上，ACC-M比ACC-2更為強烈。結論 鑒于Id-1對ACC細胞生長和侵襲行為的重要影響，干擾Id-1基因的表達，有望成為治療腺樣囊性癌新的有效方法之一。

DNA結合抑制蛋白-1； 腺樣囊性癌； 增殖； 侵襲

腺樣囊性癌（adenoid cystic carcinoma，ACC）是發生于頭頸部涎腺最常見的惡性腫瘤，約占所有惡性腫瘤20%[1]，具有高度的侵襲和轉移特性[2]。由于對ACC生物學性質認識上的局限性，目前尚無很有效的治療措施，即使進行了廣泛的手術切除及放射治療，大多數患者最終還是出現復發和轉移[3]。臨床上急需尋求治療ACC的新方法。

DNA結合抑制蛋白（inhibitor of DNA binding，Id）屬于螺旋-環-螺旋（helix-loop-helix，HLH）轉錄調節因子家族，在細胞生長和分化方面具有廣泛的調節作用。Id蛋白有4個家族：Id-1、Id-2、Id-3、 Id-4，目前研究[4-5]發現：Id-1與人類多種腫瘤的發生發展有密切的關系。然而在ACC中，Id-1的表達量如何，其對ACC的生長和侵襲能力的影響尚不得而知。

ACC-M和ACC-2分別是涎腺腺樣囊性癌肺高轉移細胞株和低轉移細胞株，本研究通過檢測其Id-1基因的表達，以及Id-1 RNA干擾前后2個細胞系的生長和侵襲能力的變化，探討Id-1基因對ACC的生長和侵襲能力的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

腺樣囊性癌細胞系ACC-M（購自中國典型培養物保藏中心），ACC-2（山東大學齊魯醫院腫瘤中心實驗室凍存）；DMEM（Gibco公司，美國），opti-MEM（Invitrogen公司，美國），胎牛血清（Gibco公司，美國），脂質體Lipofectamine2000（Invitrogen公司，美國），兔抗鼠Id-1抗體（SC-488，Santa Cruz公司，美國），FITC標記的羊抗兔抗體（Southern Biotech公司，美國），Id-1 siRNA（Invitrogen公司，美國），噻唑藍（Sigma公司，美國）；BioCoat Matrigel侵襲小室（24孔，8μm，Becton Dickinson公司，美國），LSM710激光掃描共聚焦顯微鏡（Zeiss公司，德國）。

1.2 細胞培養

腺樣囊性癌細胞系ACC-M和ACC-2解凍復蘇，于含10%胎牛血清的DMEM培養基、37℃、含5% CO2的細胞培養箱中密閉培養。不加入青霉素和鏈霉素。

1.3 RNA干擾

應用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）沉默Id-1基因。ACC-M和ACC-2分別分為4組：空白對照組、脂質體對照組、序列錯配siRNA組和Id-1siRNA組。取處于對數生長期的細胞，調整細胞密度為每孔1×105個接種于6孔板，在含10%胎牛血清的DMEM中培養24 h，將培養基換成無胎牛血清的opti-MEM，培養至細胞貼壁長滿底面積的50%時行轉染實驗。每孔加入100 pmol Id-1 siRNA和5μL lipofectamine2000。Id-1（NM_002165）siRNA序列：5’-UGAGUAACAGCCGUUCAUGUCGUAG-3’，5’-CUACGACAUGAACGGCUGUUACUCA-3’。

1.4 免疫熒光確認干擾成功

制備單細胞來源細胞爬片，0.01 mol·L-1PBS清洗5min×3次；2.5mL·L-1TritonX-100處理15min；PBS振洗5min×3次。正常羊血清封閉。一抗滴加1∶150稀釋的兔抗鼠Id-1抗體，4℃濕盒過夜，37℃復溫1 h，PBS振洗5min×3次；分別滴加1∶50稀釋的FITC標記的羊抗兔二抗，37℃孵育1 h，PBS振洗5min×2次，蒸餾水振洗1次，用500mL·L-1無熒光緩沖液甘油封片，陰性對照用PBS代替一抗，其余步驟不變。使用激光掃描共聚焦顯微鏡（激發波長488 nm）進行觀察和定量檢測。

1.5 RNA干擾前后的RT-PCR和Western blot檢測

1.5.1 總RNA的提取及RT-PCR擴增 用Trizol常規提取ACC-M和ACC-2細胞總RNA，經逆轉錄合成cDNA進行PCR反應。采用高保真Taq DNA聚合酶進行PCR擴增。引物序列見表1。擴增條件為：95℃5min，94℃ 40 s,56℃ 40 s，72℃ 40 s，36個循環。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分離，分離得到的條帶用計算機圖像分析軟件進行。

表1 引物序列以及PCR產物大小Tab 1 Primer sequences and size of PCR products

1.5.2 Western blot檢測ACC-M和ACC-2細胞RNA干擾前后Id-1蛋白的表達 細胞培養72 h以后常規方法提取細胞總蛋白。灌制15%的SDS-PAGE凝膠，每孔上樣20mg，電泳分離，轉膜。2%BSA室溫封閉1 h；一抗室溫孵育1 h（其中兔抗鼠Id-1一抗質量濃度為1 g·mL-1，β-actin以1∶5 000稀釋）；用TBST洗3遍；二抗室溫孵育1 h（抗兔IgG 1∶1 000稀釋）；TBST洗3遍。最后用化學發光試劑檢測信號，條帶強度應用圖像分析軟件進行分析。

1.6 細胞生長曲線

接種上述細胞于96孔板，接種密度為每毫升5×104個，每孔接種0.2mL，轉染24、48、72 h后，應用MTT比色法于570 nm處測定吸光度A值，描記細胞的生長曲線，每組設6個樣本。

1.7 細胞侵襲性

50mg·L-1Matrigel 1∶8稀釋液包被Transwell小室底部，4℃風干。上室加入含有1×104個細胞的100μL DMEM，下室加入含有條件培養基作為趨化因子的600μL DMEM，孵育20 h以后，取出Transwell小室，PBS淋洗，用棉簽擦去微孔膜上層的細胞，95%乙醇固定，蘇木素染色。在200倍倒置顯微鏡下計數移至微孔膜下層的細胞。每個樣本計數6個視野。

1.8 統計學分析

測量數據以均數±標準差表示，采用SPSS 10.0統計學軟件進行t檢驗和ANOVA檢驗。P<0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 免疫熒光檢測Id-1表達

干擾前，ACC-M和ACC-2均表達Id-1，其中ACC-M表達量遠高于ACC-2（圖1）。干擾后，ACCM和ACC-2的Id-1表達量均明顯下降，而ACC-M的下降量尤為顯著（圖1）。Id-1 siRNA組均與空白對照組、脂質體對照組以及序列錯配組有顯著差異（均為P＜0.01），空白對照組、脂質體對照組和序列錯配組之間并無顯著差異（均為P＞0.05）。

2.2 RT-PCR和Western blot檢測RNA干擾前后Id-1表達

RT-PCR和Western blot結果見圖2。RT-PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測到的Id-1mRNA水平和Western blot檢測到的Id-1蛋白水平結果一致：干擾前，ACC-M和ACC-2均表達Id-1，ACC-M表達量遠高于ACC-2；干擾后，ACC-M和ACC-2的Id-1表達量均明顯下降，而ACC-M的下降量尤為顯著。Id-1 siRNA組與空白對照組、脂質體對照組以及序列錯配組有顯著差異（均為P＜0.01），空白對照組、脂質體對照組和序列錯配組間無顯著差異（均為P＞0.05）。

2.3 細胞生長曲線

干擾前，ACC-M和ACC-2均正常生長，其中ACC-M生長速度遠快于ACC-2。干擾后，ACC-M和ACC-2的生長速度均明顯減慢，而ACC-M的減慢尤為顯著（圖3）。Id-1 siRNA組均與空白對照組、脂質體對照組以及序列錯配組有差異，且差異有統計學意義（均為P＜0.01），空白對照組、脂質體對照組和序列錯配組之間相比，差異無統計學意義（均為P＞0.05）。

2.4 細胞侵襲性

干擾前，ACC-M和ACC-2均具有侵襲性，其中ACC-M侵襲性遠大于ACC-2（圖4）。干擾后，ACCM和ACC-2的侵襲性均明顯減小，而ACC-M的減小尤為顯著（圖4）。Id-1 siRNA組均與空白對照組、脂質體對照組以及序列錯配組有差異，且差異有統計學意義（均為P＜0.01），空白對照組、脂質體對照組和序列錯配組之間相比，差異無統計學意義（均為P＞0.05）。

圖3 ACC-M和ACC-2細胞生長曲線Fig 3 The cell proliferation curves of ACC-Mand ACC-2 cells

圖4 ACC-M和ACC-2細胞Transwell侵襲能力檢測Fig 4 Invasive ability of ACC-MandACC-2 cells detected by Transwell

3 討論

Id蛋白屬于HLH蛋白質超家族，相對分子質量為13 000～20 000，它是一組缺乏堿性DNA連接結構域的HLH因子。bHLH蛋白二聚體的形成是DNA與E盒（CANNTG）或N盒（CACNAG）識別序列結合的必要條件，Id蛋白通過與bHLH轉錄因子形成異型二聚體，干擾其與DNA的結合，阻斷其對下游分子的轉錄激活作用，抑制基因的表達，從而抑制細胞的正常分化，促進細胞增殖[4]。Id-1是人類迄今為止發現的4個Id蛋白家族成員中研究最多，也是最重要的一個。研究發現：Id-1在上皮來源的腫瘤中呈高表達，它通過抑制細胞正常分化、推進細胞周期進程、誘導細胞增殖、抑制衰老、誘導侵襲、參與腫瘤性血管新生而介導腫瘤的發生和發展[6-9]；在大腸癌、食管癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌的發生發展過程中都發揮著重要的作用[10-14]。

ACC是口腔頜面部常見的涎腺惡性腫瘤，其臨床生物學行為突出特征之一是易發生肺轉移，轉移率高達40%以上[1-2]。ACC-M（涎腺腺樣囊性癌肺高轉移細胞株）和ACC-2（涎腺腺樣囊性癌肺低轉移細胞株）這2種細胞為同一親本，二者的差異集中在轉移表型上，轉移性具有顯著差異，ACC-M轉移率為96%，ACC-2轉移率為18%[15]。追其本源，ACC-M細胞株是由ACC-2細胞株單克隆培養而來，前者的增殖能力和侵襲能力遠遠強于后者。本研究發現：ACC-M中Id-1的表達量遠遠高于ACC-2，提示Id-1的表達量與ACC-M和ACC-2增殖和侵襲能力的差別是成正相關的，即Id-1表達的不同可能造成ACC-M和ACC-2增殖和侵襲能力的不同。

以往研究發現的與腫瘤相關的Id-1信號通路有很多，有Akt介導的Wnt、p53和NF-kappa B、PI3K/ Akt/NF-kappa B和Erk/MAPK信號通路[16-19]等。本課題組前期研究發現：正常涎腺組織中Id-1的表達量非常低（甚至難以檢測到），但是在涎腺腺樣囊性癌中卻呈現高表達，這說明Id-1表達水平的升高可能打破了正常細胞內癌基因與抑癌基因相互制約的平衡關系，進而激活某條或多條信號傳導通路推進細胞周期進程、抑制細胞分化、促進細胞增殖，從而誘導正常細胞向腫瘤細胞轉化，增加通過淋巴管道和血道向周圍淋巴結和遠處器官侵襲和轉移的機會。

本研究發現：在ACC-M和ACC-2中，Id-1均有表達，ACC-M表達量高于ACC-2；通過RNA干擾沉默Id-1基因后，ACC-M和ACC-2生長均受到抑制，ACC-M比ACC-2受到更強烈的抑制；同樣，通過RNA干擾沉默Id-1基因后，ACC-M和ACC-2侵襲能力均受到抑制，ACC-M比ACC-2受到更強烈的抑制。其機制可能是通過沉默Id-1基因，腺樣囊性癌細胞系ACC-M和ACC-2本來呈現高表達的Id-1出現低表達或者無表達，本來被打破了的癌基因與抑癌基因相互制約的平衡關系恢復了正常，激活了的某些信號傳導通路得到抑制或者關閉，抑制細胞周期進程、促進細胞分化、抑制細胞增殖，抑制了通過淋巴管道和血道向周圍淋巴結和遠處器官侵襲和轉移的機會。但是Id-1對ACC生長和侵襲起調節作用的精確信號傳導通路，還有待進一步的研究與探討。

本研究表明：應用siRNA沉默Id-1基因，可以顯著抑制ACC-M和ACC-2細胞的生長和侵襲。提示干擾Id-1基因的表達，可能有望成為治療腺樣囊性癌新的有效方法。

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（本文編輯 湯亞玲）

Effects of silencing inhibitor of DNA binding-1 gene on the grow th and invasiveness of adenoid cystic carcinoma cells

LIU Pei1,ZHANG Xiang-hong2,HU Zhen-sheng1,SUN Shan-zhen3,LIU Shao-hua4,WEI Feng-cai4.（1.Dept.of Plastic Surgery,Qilu Hospital,Shandong University,Jinan250012,China；2.Dept.of Histology and Embryology,School of Medicine,Shandong University,Jinan250012,China；3.Dept.of Pathology,School of Stomatology,Shandong University,Jinan250012,China；4.Research Section of Stomatology,Qilu Hospital,Shandong University,Jinan250012,China）

ObjectiveTo investigate the role of inhibitor of DNA binding-1（Id-1）gene in adenoid cystic carcinoma cell growth and invasion behavior.MethodsWith salivary adenoid cystic carcinoma cell lines ACC-Mand ACC-2,dedected Id-1 gene expression was screened with immunofluorescence assay.After Id-1 mRNA knockingdown using small interfering RNA,RT-PCR and Western blot were used to detect the different expressions before and after interference,and the growth of cells before and after interference was deceted using the MTT assay,and the cell invasion ability was checked with the use of Transwell chamber assay.Results Id-1 were both expressed in the ACC-Mand ACC-2,and the expression in ACC-M was higher than that in ACC-2.After Id-1 RNA interference,the growth and invasiveness of ACC-Mand ACC-2 were inhibited with the restrained degree in ACC-M much stronger than that in the ACC-2.ConclusionIn view of the important role of Id-1 in the behavior of growth and invasion in ACC cell,interfering the expression of Id-1 gene is expected to be a novel and effective means for the treatment of adenoid cystic carcinoma.

inhibitor of DNA binding-1； adenoid cystic carcinoma； proliferation； invasion

R 739.87

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.01.016

1000－1182（2011）01－0066-05

2009-11-25；

2010-03-02

國家自然科學基金資助項目（30672339）；教育部留學回國人員科研啟動基金資助項目（2007）

劉培（1982—），女，山東人，博士

劉少華，Tel：0531-82169247