扁穗冰草轉錄因子基因的克隆和表達特性的分析

張 楠,朱維寧,蘇君藝,張林生

(西北農林科技大學生命科學學院 旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西 楊凌 712100)

植物在受到干旱、寒冷、鹽堿等非生物脅迫時體內會被誘導產生多種轉錄因子，這些轉錄因子直接結合或間接作用于基因啟動子區域，調控一系列相關基因的表達，進而對植物體產生保護效應[1-2]。自從Paz-Ares等[3]首次克隆了玉米(Zeamays)的轉錄因子基因C1 以來，已有多種調控干旱、鹽漬、低溫等相關基因表達的轉錄因子基因被分離克隆。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，已經有超過50個家族至少1 700個編碼轉錄因子的基因被克隆出來[4-8]，其中一部分基因是與干旱脅迫相關[9-10]。例如：bZIP家族的AREB/ABF基因可以對干旱產生響應[11]，NAC基因家族的轉錄因子ANAC019、ANAC055和ANAC072則被干旱、高鹽和ABA誘導表達[12]，而AP2/ERF基因家族的DREB1亞家族轉錄因子通常被低溫誘導[13]。大量研究表明，轉錄因子在植物對干旱、低溫、鹽堿、高溫等脅迫響應時啟動自身體內自我保護系統方面有著重要的作用[14-17]。

扁穗冰草(Agropyroncristatum)是分布于干旱、半干旱及高寒地區的多年生牧草。扁穗冰草具有較強的抗旱、抗寒性，可作為干旱地區水土保持和綠化植物，生態價值較高[18-19]。目前，轉錄因子在整個冰草屬中的研究鮮見報道，本研究對已報道的一些禾本科植物的轉錄因子基因序列進行比對分析，根據核酸序列的保守區域設計引物，采用RT-PCR技術、半定量RT-PCR技術來研究扁穗冰草遇寒冷及干旱脅迫時的相關基因表達趨勢，以期為深入研究轉錄因子在逆境脅迫下的細胞信號應答及作用機理提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1供試材料 扁穗冰草種子由西北農林科技大學生命科學學院中心實驗室提供。

1.2試劑 RNA提取試劑Trizol、逆轉錄試劑盒，購自大連寶生物(TaKaRa)公司；pGEM-T Easy Vector 購自Promega公司；DNA分子Marker、凝膠回收試劑盒等購自北京天根公司；Taq DNA 聚合酶(2×taqmix)購自沃爾森公司，其他試劑均為分析純。

1.3RT-PCR克隆目的基因及半定量RT-PCR

1.3.1冷脅迫 扁穗冰草種子在恒溫培養箱內25 ℃蛭石培養，稱重法控制含水量，至地上部分高約20 cm時，分別置于4 ℃ 12 h、4 ℃ 24 h、4 ℃ 36 h、4 ℃ 60 h，后恢復至25 ℃12 h，采集各脅迫時期的冰草葉片。

1.3.2干旱脅迫 扁穗冰草種子在恒溫培養箱內25 ℃蛭石培養，稱重法控制含水量，至地上部分高約20 cm時，自然干旱至含水量為20%，然后分別在第1天、第3天、第5天、第7天及復水1 d時，采集各脅迫時期冰草葉片。

1.3.3RNA提取及半定量RT-PCR 參照Trizol 試劑的操作說明提取各脅迫處理時期的扁穗冰草葉片RNA,以提取的RNA為模板，使用逆轉錄試劑盒(Takara)反轉錄合成cDNA第一鏈。RT產物于-20 ℃下保存。利用DNAMAN 對已報道在GenBank中的禾本科植物的cbf,dreb,myb轉錄因子進行比對，針對其保守區，使用Primer Premier 5.0設計3對引物(引物由上海生工合成)。選用扁穗冰草肌動蛋白基因ACβ-actin(GenBank登錄號：JN007031)作為內標基因。通過預試驗探索確定半定量試驗條件(表1)。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析和回收純化后的目的產物與pGEM-T Easy Vector 連接,轉化至大腸桿菌感受態細胞JM109中,經藍白斑篩選及菌落PCR鑒定后,送至上海桑尼公司測序。將目的片段在NCBI網站上進行nBlast并分析。

表1 半定量RT-PCR中基因名稱、引物序列、PCR程序及擴增片段長度

2 結果與分析

2.1扁穗冰草轉錄因子cDNA的克隆與測序 將提取的扁穗冰草總RNA反轉錄后,用設計的引物進行RT-PCR擴增，3個擴增片段大小與預期大小一致(圖1)。因此，初步認定是扁穗冰草中的目的基因片段，將其分別命名為ACcbf,ACdreb,ACmyb,擴增產物經過回收，連接轉化并克隆測序。序列分別為548,862,319 bp, 測序結果如圖2所示。將這3個序列上傳GenBank，登錄號分別為：JF957078，JF957079，JF957080。3個基因片段在NCBI 網站上的nBlast結果表明，各基因片段的序列與相應同源基因序列的相似度基本都能達到90%以上(表2)，因此，認為得到的序列是目的基因。

圖1 目的基因片段擴增瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 扁穗冰草中ACcbf,ACdreb,ACmyb基因序列

2.2不同冷脅迫程度下扁穗冰草轉錄因子表達的半定量RT-PCR分析 不同冷脅迫程度下各基因的半定量RT-PCR結果表明(圖3)，ACcbf基因隨冷脅迫程度的增強表達量增加，恢復到室溫后，表達量開始降低。ACdreb與ACcbf基因的表達趨勢基本一致，這說明兩者對低溫脅迫能夠產生響應。而ACmyb基因在脅迫前后表達量變化不大,說明該基因對溫度變化不敏感。

2.3不同干旱脅迫程度下扁穗冰草轉錄因子表達的半定量RT-PCR分析 不同干旱脅迫程度下各基因的半定量RT-PCR結果表明(圖4)，ACcbf 基因在脅迫前未表達，脅迫后表達量增加，而在復水1 d后，表達量降低，說明該基因對干旱脅迫能產生響應。但由于整體表達量較低，認為該基因對于干旱只有一定程度的響應，不敏感。ACdreb基因在脅迫后表達量增加，復水1 d后，表達量降低，說明該基因是受到干旱脅迫調控的。而ACmyb基因出現了和前兩個基因一樣的趨勢，復水后仍然比對照組中表達量高，推測該基因是一種干旱應答轉錄因子基因，并且其表達有一定的延續性。

綜合低溫和干旱兩種脅迫下的結果，認為ACcbf基因是一種低溫敏感基因，同時對干旱脅迫產生一定的響應，但不明顯。ACdreb基因是一種對低溫和干旱脅迫都能夠產生應答的基因，推測這是該基因對干旱和寒冷都能導致的植物脫水所產生的響應。ACmyb基因對干旱脅迫能產生響應，對低溫脅迫不敏感。

表2 ACcbf，ACdreb，ACmyb與其他植物中同源基因的相似度

圖3 不同冷脅迫程度下扁穗冰草轉錄因子半定量RT-PCR

圖4 不同干旱脅迫程度下扁穗冰草轉錄因子半定量RT-PCR

3 討論

本研究首次在扁穗冰草中克隆出3個不同的轉錄因子基因片段并對這3個基因在冷脅迫和干旱脅迫下的表達進行研究，試驗結果發現各基因的表達與逆境脅迫程度成正相關，這與已報道的研究結論基本一致[20-23]。由于各種逆境之間的交叉效應對于研究的影響和植物抗逆信號轉導的復雜性，不能簡單地判斷某一基因對于特定逆境脅迫能產生特異的響應。例如，干旱、寒冷、鹽堿都能導致植物脫水，因此，在冷脅迫及干旱脅迫下出現同樣的表達趨勢是正常的。這為試驗結果的分析帶來了難度。為了進一步研究該基因的表達調控模式，下一步還須通過RACE技術克隆這3個基因的全長序列，尋找其CDS并進行轉基因等功能研究，以明確其表達調控模式。

目前對轉錄因子調控表達的研究主要側重于對單一逆境條件的調控, 對其在不同信號途徑相互作用過程中的調控機制還沒有深入的研究。在轉基因試驗中也出現了很多大田研究和實驗室研究不吻合的結果[24]。因此，欲將轉錄因子應用于作物的轉基因或者遺傳育種，對于這類基因表達過程的信號轉導以及轉錄、翻譯的調控還需要進一步的研究。本研究對扁穗冰草中的轉錄因子進行了初步探索，為設計相應的核酸探針、深入分析這類基因的轉錄及表達機制進而應用于作物遺傳育種提供參考。

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