RhoA-ROCK介導的Moesin磷酸化對晚期糖基化終產物誘導的內皮細胞形態和功能改變的調節作用

劉紅霞 馮國開 杜 靜 郭曉華 黃巧冰

南方醫科大學基礎醫學院病理生理教研室

RhoA-ROCK介導的Moesin磷酸化對晚期糖基化終產物誘導的內皮細胞形態和功能改變的調節作用

劉紅霞 馮國開 杜 靜 郭曉華 黃巧冰

南方醫科大學基礎醫學院病理生理教研室

目的：驗證Rho A／ROCK信號通路參與晚期糖基化終產物（AGE）引起的膜突蛋白（Moesin）磷酸化，ROCK通過與Moesin直接作用導致Moesin磷酸化，探討AGE引起Moesin磷酸化的位點及其生物學效應。方法：選用Rho A顯性負效突變體（Rho AN19）和組成型活性突變體（Rho AL63）的重組腺病毒感染細胞，應用G-LISA試劑盒及免疫印跡法檢測Rho A活性及ROCK、Moesin磷酸化水平，并采用ROCK抑制劑處理細胞，明確Rho A／ROCK通路是否參與AGE介導的Moesin磷酸化；通過免疫共沉淀方法檢測ROCK與Moesin的相互作用，了解ROCK引起Moesin磷酸化的方式；通過分子克隆及體外定點突變技術構建Moesin的真核表達質粒pcDNA3／HA-Moesin及其突變體pcDNA3／HA-Moesin T558A 和pcDNA3／HA-Moesin T558D，經脂質體轉染內皮細胞，運用免疫印跡、單層內皮細胞通透性測定及內皮細胞骨架纖維狀肌動蛋白（F-actin）形態和定位檢測，查明在AGEs誘導下的Moesin磷酸化位點。結果：AGE以時間和劑量依賴方式引起內皮細胞Rho A活性增高，改變Rho A活性，可以影響ROCK及Moesin的磷酸化水平；使用ROCK抑制劑，可減少Moesin磷酸化。ROCK通過直接與Moesin相互作用，導致Moesin磷酸化。用丙氨酸替代Moesin的558位蘇氨酸抑制型突變體（pcDNA3-HA-Moesin T558A）可以降低AGEs引起的Moesin磷酸化水平、內皮細胞通透性，并改善AGEs引起的F-actin重排。而用天冬氨酸替代558位蘇氨酸的激活型突變體（pc DNA3-HA-Moesin T558D）可以模擬AGEs引起的Moesin磷酸化水平、內皮細胞通透性及F—actin重排。結論：AGE通過激活Rho A活性進而導致其下游靶分子ROCK磷酸化，并通過直接與Moesin蛋白相互作用導致其磷酸化激活，進而引起內皮細胞形態和功能的改變。AGE引起Moesin蛋白活化的位點為第558位蘇氨酸磷酸化位點（T558），抑制T558位點磷酸化可改善AGEs誘導的內皮細胞形態與功能的改變。

本課題為國家自然科學基金No.30771028；教育部創新團隊項目No.IRT0730