嗜熱石油降解菌YBW1的篩選、鑒定及性能研究

付 烈,周 穩,王俊卿,曾一梅,熊 平,汪浩勇

(湖北工業大學生物工程學院,湖北 武漢 430068)

利用微生物提高石油采收率(MEOR)可以通過多種作用機理來提高原油開采率,是目前公認的開采油藏中剩余油和枯竭油藏最好的廉價采油方法[1].而當前應用于MEOR的菌株主要是一些嗜溫菌[2-3],無法在一些高溫油藏的開采中發揮作用.因此,嗜熱石油降解菌的篩選及降解機理就逐漸成為當前研究的熱點.目前國內外已報道的嗜熱石油降解菌存在著種類少、降解性能不夠理想的問題.本文就新的嗜熱石油降解微生物的篩選及其降解特性進行了研究.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 實驗樣品采自湖北省江漢油田王一站地下高溫儲水.

1.1.2 培養基 LB培養基[4].基礎培養基(g/L):Na2HPO4,0.6 g;KH2PO4,0.2 g;NaNO3,4 g;CaCl2,0.01 g;FeSO4,0.01 g;MgSO4,0.3 g;酵母粉,0.1 g;PH值7.2[5].原油培養基:基礎培養基中分別添加體積分數為0.1%、2%、60%的原油.液體石蠟培養基:基礎培養基中添加體積分數為2%的液體石蠟.

1.2 方法

1.2.1 菌株分離 將地下儲水在70℃培養箱溫浴15 d后,直接涂LB平板獲取單菌落.挑取不同形態單菌落接種至LB培養基70℃過夜培養.將培養液按5%的接種量分別接種至100 mL體積分數為2%的液體石蠟培養基70℃培養7 d.再將培養液按5%的接種量轉接至100 mL 2%(體積分數)原油培養基70℃培養15 d,觀察原油乳化情況,并且采用平板計數法兩天測一次菌液中的活菌數.最后選擇原油乳化效果最好、細菌生長最旺盛的細菌進行下一步實驗.

1.2.2 菌株的鑒定 生理生化特征鑒定見文獻[6-7],菌株的總DNA提取見文獻[8].16S rDNA的擴增采用細菌通用引物:8UA forward:5'-AGA GT T TGA TCMTGG CTC AG-3',reverse:5'-ACG GCT ACC T TG TTA CGA CT T-3',擴增條件參照pfu DNA聚合酶(CASarrary)使用說明書.PCR產物的回收采用Gel Extraction Mini Kit(安比奧生物技術公司)完成.純化產物確認后,采用T/A克隆法克隆到pMD18-T Vector(TaKaRa公司)上送華大基因公司測序.將結果在 Genebank中進行BLAST比對后,用Clustal X 1.8和MEGA4.1軟件構建系統發育樹[9-10].

最適生長溫度測試采用LB培養基培養細菌,尤尼柯UV2000紫外可見分光光度計在600 nm處測量.

1.2.3 菌株在不同烷烴培養基中的生長能力測試

將新鮮單菌落接入LB液體培養基中,65℃過夜培養.分別將5 mL培養液用滅菌生理鹽水洗兩遍再接種至含2%(體積分數)石油和2%(體積分數)液體石蠟的100 mL基礎培養基,不添加石油和液體石蠟的為對照.在65℃、150 r/min培養 18 d,不同時間間隔取樣測CFU值.

1.2.4 菌株降黏測試 以5%的接種量將過夜培養液接入 100 mL原油培養基(原油體積分數為60%),65℃、150 r/min培養18 d.低速離心分離油水混合物,吸取上層原油,在50℃采用 NDJ-8S數顯黏度計(上海)測定黏度.與不接菌的對照相比較計算降黏率.

1.2.5 不同鼠李糖脂濃度對菌株石油降解率的影響 以5%的接種量將過夜培養液分別接入含不同體積分數的鼠李糖脂(0.05%,0.1%,0.2%,0.3%,0.4%,0.6%,0.7%)的原油培養基(原油體積分數為0.1%),以不接種的原油培養基為對照,置于65℃、150 r/min培養18 d,將培養液倒入分液漏斗中,加入20 g NaCl和5 mL H2SO4搖勻,用 30 mL正己烷萃取.取1 mL萃取液注入25 mL容量瓶里,加正己烷定容.在芳烴特征吸收峰波長256 nm處以正己烷為參比測定吸光度,根據事先準備的標準曲線計算原油降解率[11].

2 結果與分析

2.1 菌株篩選

經過分離從樣品中獲得6株能夠乳化原油且生長比較旺盛的菌株,反復實驗確認后選取一株乳化效果最好生長最旺盛的原油降解菌,命名為YBW1.

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態學和生理生化鑒定 將YBW1進行形態觀察及生理生化實驗,其結果如下:菌落顏色,黃褐色;菌落形態,圓形、光滑 ;菌體寬度,0.6～1 μ m;菌體長度,2～3.5 μ m,革蘭氏染色,+;菌體形狀,桿狀;芽孢,內生孢子;運動性,-;過氧化氫酶,+;氧氣需求,好氧.最適溫度測試表明其生長范圍為45～75℃,最適生長溫度為65℃(圖 1).

圖1 菌株YBW1生長溫度曲線

2.2.2 菌株的16S rDNA鑒定 對菌株YBW1的總DNA進行16S rDNA PCR擴增得到約1.5 kb大小的產物(圖2).將PCR產物回收、測序,得到1518 bp大小的16S rDNA片段.通過BLAST比對和系統發育樹(圖 3)分析表明菌株 YBW1與Geobacillus kaustophilus的序列的相似度為100%,進化距離最近.

圖2 菌株YBW116S rDNA PCR產物

圖3 菌株YBW116S rDNA系統發育樹

2.3 生長能力測試

活菌計數獲得YBW1的生長曲線(圖4)表明菌株YBW1在接種后首先會利用培養基中的酵母粉進行生長,但經過3～6 d的適應期,YBW1會先后開始利用液體石蠟和原油中的碳源生長.在第10—13 d,YBW1達到最大生長量,此后隨著可利用的碳源逐漸減少,活菌數量也逐步降低.

圖4 菌株YBW1生長能力測試曲線

2.4 原油降黏測試

通過對原油的黏度測試,被菌株YBW1作用后原油黏度從65 mPa·s降低到53 mPa·s,降黏率為18.5%.表明菌株YBW1在生長過程中可能降解了部分長鏈烷烴和產生某種起到降黏作用的生物表面活性劑.

2.5 不同鼠李糖脂濃度下菌株石油降解率的測定

菌株在不同鼠李糖脂濃度下經過15 d的作用.原油降解率測定結果(圖5)表明:最佳鼠李糖脂添加量為0.2%,此時獲得最大原油降解率14.3%.當鼠李糖脂添加量高于0.3%后會不同程度降低原油降解率.

圖5 菌株YBW1在不同鼠李糖脂濃度下原油降解率

3 結論

石油降解菌廣泛存在于被石油污染的土壤、河流和海洋中,并且受環境影響較大.本文選擇油田地下高溫儲水為樣品成功分離出了一株嗜熱石油降解菌——YBW1.在傳統的生理生化鑒定基礎上采用分子生物學方法,更加準確地鑒定出該菌為Geobacillus kaustophilus.

在生長能力測試中,菌株YBW1在培養初期的生長速度沒有在液體石蠟中的快.原因可能是液體石蠟所含有的主要是C12-C18的烷烴,比較容易分散在水中被利用.而原油是由多種不能溶解的成分組成,其中主要是一些長鏈烷烴(C20以上).所以YBW1會經歷一個較長的適應期來產生一些生物表面活性劑使原油乳化,從而達到對原油利用的目的.當原油中的長鏈烷烴被利用后,原油的黏度也就會降低.這也是YBW1能降低原油黏度和和鼠李糖脂表面活性劑能提高原油降解率的原因.不過,當鼠李糖脂的量過多時會對細菌的細胞膜產生破壞作用抑制細菌生長[12],從而導致原油降解率下降.

近年來極端環境微生物的研究逐漸成為微生物學研究的重點,本文在嗜熱石油降解微生物方面做了一些初步探索.下一階段的研究重點將會放在菌株YBW1利用不同石油烴組分生長和烷烴降解機理的研究上.

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