低氧環(huán)境和血清饑餓對內皮祖細胞死亡率的影響

連 鋒 薛 松 顧 萍 張谷蘭 吳學軍 朱洪生

低氧環(huán)境和血清饑餓對內皮祖細胞死亡率的影響

連 鋒 薛 松 顧 萍 張谷蘭 吳學軍 朱洪生

目的 探討低氧環(huán)境和血清饑餓對骨髓來源內皮祖細胞死亡率的影響。方法 取SD大鼠骨髓，分離出內皮祖細胞，并用免疫熒光法鑒定。取第2代細胞，分別在常氧環(huán)境（21%O2）合并正常血清（20%濃度）或血清饑餓（0%、2%濃度）條件下培養(yǎng)48 h，或是低氧環(huán)境（3%O2）合并正常血清或血清饑餓條件下培養(yǎng) 48 h、72 h、96 h、120 h。用Live/ Dead染色，結合圖像分析，計算細胞死亡率。結果 短期處于低氧環(huán)境中，內皮祖細胞的死亡率無明顯變化（P＞0．05）。在血清饑餓條件下，細胞死亡率顯著升高（P＜0．01）。如果長期處于低氧環(huán)境中，與正常血清培養(yǎng)相比，血清饑餓培養(yǎng)時細胞死亡率顯著升高（P＜0．01），72 h時達（96．30±3．18）%，120 h時達100%。結論 缺氧環(huán)境和血清饑餓對內皮祖細胞的存活均有不良影響，其中血清饑餓的影響更大。

內皮祖細胞 血清饑餓 缺氧 死亡率

內皮祖細胞（Endothelial Progenitor Cell，EPCs）參與血管建立的兩個過程：血管發(fā)生（Vasculogenesis）和血管生成(Angiogenesis)[1-2]。研究發(fā)現，EPCs移植到缺血心肌后，能改善心功能，因此有望用于缺血性心臟病的干細胞治療[3-4]。目前主要的技術瓶頸是，移植后不久EPCs即大量死亡，有研究表明，短期內絕大多數移植于缺血心肌的干細胞死亡，導致移植效果不夠理想[5-6]，我們考慮這可能與病變局部缺血和缺氧有關。為驗證這一設想，本實驗在低氧和血清饑餓環(huán)境中培養(yǎng)EPCs，并比較不同培養(yǎng)條件下的細胞死亡率。

1 材料和方法

1.1 動物

SD大鼠，雄性，6～8月齡，體質量300～350 g（上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院實驗動物中心）。

1.2 實驗材料

戊巴比妥鈉 （上?；瘜W試劑公司）；IMDM培養(yǎng)基(Invitrogen，美國)；胎牛血清（Invitrogen,美國）；0．25%胰蛋白酶（Gibco，美國）；血管內皮生長因子（VEGF，Sigma，美國）；堿性成纖維細胞生長因子（bFGF，Sigma，美國）；淋巴細胞分離液（中國科學院生物工程研究所）；纖維粘連蛋白 （FN，Sigma，美國）；兔抗鼠 CD31抗體（Santa cruz，美國）；兔抗鼠CD34抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；兔抗鼠Flk-1抗體（Santa cruz，美國）；兔抗鼠vWF抗體（DAKO，丹麥）；激光共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss，德國 ），Live/Dead viability/cytotoxicity kit（Molecular Probes，美國）。

實驗用培養(yǎng)液含有低糖 IMDM，胎牛血清（FBS），血管內皮生長因子 （VEGF）30 μL/mL和bFGF 10 μL/mL。

1.3 EPCs的分離、培養(yǎng)

1%的戊巴比妥鈉（30 mg/Kg）腹腔內注射麻醉SD大鼠。大鼠仰臥位，固定在手術臺上，下肢備皮消毒。逐層切開皮膚、肌肉，暴露股骨，剪開股骨兩端，用含肝素4 000 IU的生理鹽水10 mL反復沖洗骨髓腔，所得骨髓液用IMDM稀釋備用。

采用密度梯度離心法，淋巴細胞分離液密度1．088，2 000 r/min離心25 min，然后用毛細吸管吸取中間云霧層（即單核細胞層）。置入另一離心管，加入5倍體積的IMDM洗滌2次，每次1 300 r/min離心5 min，棄上清，加入IMDM重懸細胞。以1×106cell/mL的濃度接種到涂有FN的培養(yǎng)皿，加入培養(yǎng)液，將培養(yǎng)皿置入37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱。3 d后更換培養(yǎng)液，同時棄去未貼壁的細胞，此后每隔3天換液。10 d左右，待貼壁細胞幾乎完全鋪滿培養(yǎng)皿底，用0．25%胰蛋白酶消化、傳代。

1．4 EPCs的鑒定

取第2代EPCs以1×104cells/mL濃度接種到32 mm培養(yǎng)皿（內置玻片）。培養(yǎng)7 d后用免疫熒光染色法鑒定內皮標志物CD31、CD34、Flk-1和vWF。操作步驟如下：加入40 g/L的多聚甲醛，在4℃下固定20 min,PBS洗滌3次；0．01%Triton-X 100孵育3 min，PBS洗滌3次；滴加3%雙氧水，室溫下孵育10 min，PBS洗滌3次；滴加50 g/L牛血清白蛋白（BSA），室溫下封閉60 min。在不同的玻片上，分別滴加兔抗鼠CD31抗體、兔抗鼠CD34抗體、兔抗鼠Flk21抗體和兔抗鼠vWF抗體，均以1∶200的比例稀釋，4℃下過夜。PBS洗滌3次，每次5 min，然后分別滴加1∶100山羊抗兔IgG2FITC，37℃下孵育2 h，再用PBS洗滌3次，每次5 min。用甘油PBS封片后,在激光共聚焦顯微鏡下觀察、記錄。對照玻片，加一抗時用PBS替代，作為陰性對照。

1.5 實驗分組和處理

取處于對數生長期的第2代EPCs，分別在常氧環(huán)境（21%O2）合并正常血清（含20%FBS）或血清饑餓（含0%、2%FBS）條件下培養(yǎng)48 h，或是低氧環(huán)境（3%O2）合并正常血清或血清饑餓條件下培養(yǎng) 48 h、72 h、96 h、120 h。每組設3孔。

1.6 細胞死亡率測定

參照試劑盒說明書，分別測定各組EPCs的死亡率。鈣黃綠素AM（Calcein AM）與活細胞的膜結合，發(fā)綠色熒光；而溴乙非啶同型二聚體（Ethidium homodimer，EthD-1）與受損細胞的核酸結合，發(fā)紅色熒光。用Leica QWIN圖像處理及分析系統，計數100個細胞，紅色細胞百分比即為細胞死亡率。每份標本重復計數3次，取平均值進行統計學分析。

1.7 統計學分析

數據用均數±標準差表示。采用SPSS 10．0軟件進行方差分析，Bonferroni法進行組間比較。P＜0．05提示差異具有統計學意義，P＜0．01提示差異具有高度統計學意義。

2 結果

2.1 內皮祖細胞的鑒定

免疫熒光染色結果顯示，貼壁細胞 CD31、CD34、Flk-1和vWF染色陽性，7 d時90%的貼壁細胞能攝取Dil-LDL（圖1～4）。

2.2 低氧環(huán)境和血清饑餓對大鼠EPCs死亡率的影響

在常氧環(huán)境下培養(yǎng)48 h，2%和0%FBS之間沒有統計學差異（P＞0．05），但上述兩組和20%FBS組死亡率相比有明顯的統計學差異（P＜0．01）。在低氧環(huán)境下培養(yǎng)48 h，20%FBS組的細胞死亡率明顯高于0%和2%FBS組（P＜0．01)，而2%和0%FBS之間沒有統計學差異（P＞0．05）。采用相同濃度的血清培養(yǎng)EPCs，低氧組和常氧組的細胞死亡率沒有統計學差異（P＞0．05）（表1）。與短期低氧（48 h）相比，長期低氧（72 h、96 h、120 h）時血清饑餓組EPCs的死亡率顯著升高（P＜0．01），但這3個時間點之間的死亡率差異無統計學意義(P＞0．05)。在各時間點，0%FBS組和2%FBS組的細胞死亡率無統計學差異（P＞0．05），但是這兩組與20%FBS組相比，細胞死亡率的差異具有統計學意義（P＜0．05）。20%FBS組在各時間點的細胞死亡率有統計學差異（P＜0．05）（表2）。

圖1 第2代細胞培養(yǎng)3天時的CD31表達（100×，標尺50 μm）Fig.1 CD31 expression in the P2 cultured cells on the 3rdday (100×,bar 50 μm)

圖2 第2代細胞培養(yǎng)3天時的CD34表達（100×，標尺50 μm）Fig.2 CD34 expression in the P2 cultured cells on the 3rdday (100×,bar 50 μm)

圖3 第2代細胞培養(yǎng)3天時的flk-1表達（100×，標尺50 μm）Fig.3 Flk-1 expression in the P2 cultured cells on the 3rdday(100×,bar 50 μm)

圖4 第2代細胞培養(yǎng)3天時的vWF表達（100×，標尺50 μm）Fig.4 vWF expression in the P2 cultured cells on the 3rdday (100×,bar 50 μm)

表1 常氧、低氧環(huán)境和不同濃度FBS對EPCs死亡率的影響（x±s）Table 1 The effect of Normal,low oxygen and different FBS concentration on EPCs mortality(x±s)

表2 在低氧環(huán)境中，采用不同血清濃度培養(yǎng)不同時間時EPCs死亡率的比較（x±s）Table 2 Comparison of EPCs mortality with different serum concentration and culture time under low oxygen(x±s)

3 討論

在缺血性心臟病的干細胞移植治療領域，如何提高移植細胞的生存率一直是個難題。EPCs治療缺血性心臟病時，需先在常氧（21%O2）、高血清（20% FBS）環(huán)境下進行擴增，然后制備細胞懸液用于移植。據報道，移植后1 h內移植細胞的存活率只有58%[7]；而在移植后24 h，只有1%的移植細胞存活[8]，具體原因和機制不明。因缺血性心臟病的基本病理要素是缺氧和缺血[9－10]，我們設想移植細胞的死亡主要與這兩種因素有關。

本實驗結果顯示，在常氧環(huán)境中，血清饑餓會明顯增加EPCs的死亡率。血清中含有一些生存所需的因子，包括營養(yǎng)物質、生長因子等。以往已經證實，EPCs的培養(yǎng)需要血管內皮生長因子（VEGF）和堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）的參與，而血清饑餓組僅含少量或不含有生長因子，影響了EPCs的存活。另一方面，短期低氧對EPCs的死亡率沒有明顯影響。這可能是因為，骨髓中特別是骨內膜（亦稱骨髓膜，為襯墊于骨髓腔內、富含血管的結締組織層，其結構與骨膜內層相似，也有造骨功能，骨內膜在X線檢查中不能顯示）中的氧濃度遠遠低于組織平均氧濃度[11]，造血干細胞對于缺氧環(huán)境比較適應。有研究表明，在體外低氧環(huán)境中培養(yǎng)造血干細胞，并不影響其自我更新[12]。據此我們認為，與低氧相比，血清饑餓對細胞存活的影響更大。

缺血組織的血管再生是一個長期、緩慢的過程，因此我們還觀察了長期低氧對細胞死亡率的影響。結果顯示，隨低氧時間的延長，血清饑餓組的細胞死亡率急劇上升，72 h即達到96.3%，120 h達100%；20%FBS組的細胞死亡率也有所升高，但是明顯低于血清饑餓組。這也證實了血清的細胞保護作用，此外還提示，長期處于低氧環(huán)境中，即使有營養(yǎng)因子，細胞存活率也會受到明顯影響。

從理論上講，2%的FBS含有少量營養(yǎng)和生長因子，對干細胞的生存率應該有所幫助[13]。但是，我們觀察到，無論在常氧還是低氧環(huán)境中，0%FBS和2% FBS組的EPCs死亡率都沒有統計學差異?？赡軐τ贓PCs來說，2%的FBS提供的營養(yǎng)因子遠遠不足以滿足細胞的生存需要。

總之，血清饑餓和長期缺氧都不利于EPCs的體外生存，其中以血清饑餓的影響更大。在EPCs移植治療缺血性心臟病時，須注意解除缺血因素，減少局部組織缺氧時間，以提高移植細胞的生存率。

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Effects of Low Oxygen and Serum Deprivation on Death Rate of Endothelial Progenitor Cells

LIAN Feng1,XUE

Song1,GU Ping2,ZHANG Gulan1,WU Xuejun1,ZHU Hongsheng1.1 Department of Cardiothoracic Surgery,Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200127,China;2 Laboratory Diagnostic Center,Shanghai Children's Medical Center,Shanghai 200127,China.Corresponding author:ZHU Hongsheng(E-mail:zhuhs@sohu.com).

Objective To explore the effects of low oxygen and serum deprivation (SD)on death rate of bone marrowderived Endothelial Progenitor Cells(EPCs)．Methods EPCs were isolated from bone marrow of Sprague-Dawley(SD)rats and identified by immunofluorescence assay．Passage 2 EPCs were exposed to normal oxygen(21%O2)and 0%,2%,or 20% fetus bovine serum(FBS)for 48 hours,or low oxygen(3%O2)and 0%,2%,or 20%FBS for 48,72,96,and 120 hours．Cell death rate was calculated by Live/Dead staining and image analysis．Results Cell death rate was not affected by low oxygen for 48 hours(P＞0．05),but affected greatly by serum deprivation(P＜0．01)．In a low-oxygen environment for longer hours,cells exposed to serum deprivation(0%,2%FBS)showed much higher death rate,as compared with cells exposed to 20%FBS (P＜0．01)．The death rate reached (96．30±3．18)%for 72 hours and 100%for 120 hours．Conclusion Survival of EPCs is affected by both low oxygen and serum deprivation,of which serum deprivation plays a more dominant role．

Endothelial progenitor cells; Serum deprivation; Low oxygen; Death rate

Q813．1＋2

A

1673-0364（2011）04-0181-05

2011年6月14日；

2011年7月7日）

10．3969/j．issn．1673-0364．2011．05．001

國家自然科學基金（30170930），上海市自然科學基金（044119715，08ZR1413600）。

200127 上海市 上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院心胸外科（連鋒，薛松， 張谷蘭，吳學軍，朱洪生）；200127 上海市 上海兒童醫(yī)學中心實驗診斷中心（顧萍）。

朱洪生（E-mail：zhuhs@sohu．com）