GFP小鼠皮膚成纖維細胞皮下注射后轉歸的實驗研究

丁小邦 王 健 曹誼林

GFP小鼠皮膚成纖維細胞皮下注射后轉歸的實驗研究

丁小邦 王 健 曹誼林

目的 研究綠色熒光蛋白轉基因小鼠（C57BL/6-gfp小鼠）皮膚成纖維細胞皮下注射后的轉歸。方法 以GFP小鼠皮膚成纖維細胞為研究對象，培養收集第3代皮膚成纖維細胞，按細胞濃度20×106cells/mL注射到裸鼠頭皮下，分別于細胞注射后1周、2周、3周、6周及12周，通過活體熒光檢測儀、組織學觀察、冰凍切片熒光顯微鏡觀察及GFP蛋白的免疫組化來研究注射部位成纖維細胞的轉歸。結果 GFP小鼠皮膚成纖維細胞皮下局部注射后2周內明顯存在，3周后注射部位成纖維細胞明顯減少，并隨時間推移逐漸減少，12周后僅有少量細胞存活。結論 單純注射成纖維細胞并依賴其存活以達到除皺的效果是非常有限。

綠色熒光蛋白 皮膚成纖維細胞 皮下注射 轉歸

臨床上尚沒有一種效果良好且持久、方法簡便易于被患者接受的除皺方式。自應用于面部除皺的可注射牛膠原出現后，注射除皺越來越被人們所青睞。目前，國內外常用的注射除皺物包括：①肉毒素；②醫用膠原和透明質酸等；③化學合成的顆粒充填劑，如PMMA（主要成份為Atecoll）等；④自體成纖維細胞注射（如Isolagen）。

自體成纖維細胞注射除皺技術是從皮膚中分離出皮膚成纖維細胞，再通過體外培養擴增，收集后回注到自體，2個月內進行3次注射。自體培養的成纖維細胞（Isolagen）是單純細胞技術在注射除皺方面的應用[1]，Watson等[2]對10例因皺紋、痤瘡后瘢痕的病例分兩組進行觀察，結果表明單純注射Isolagen組效果可持續12個月，而注射＋激光組效果更佳，且光鏡顯示術后真皮層膠原厚度和密度增加。

目前認為，自體成纖維細胞注射除皺技術的作用機制可能是多次創傷刺激組織增生，也可能是成活的皮膚成纖維細胞促進生長及膠原分泌。臨床應用發現，自體成纖維細胞注射除皺技術對細淺皺紋有一定效果，對稍深的皺紋則無效，其原因可能與單純成纖維細胞注射后細胞成活少，且細胞不易固定等因素有關。因此，有效研究成纖維細胞皮下注射后的轉歸情況，是值得探索的課題。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

綠色熒光蛋白轉基因小鼠（C57BL/6-gfp小鼠，以下簡稱GFP小鼠），雌雄不限，體質量230 g以上，由南京大學模式動物研究所提供。

裸鼠，雌雄不限，體質量230 g以上，由中國醫學科學院整形外科醫院動物室提供。

1.2 方法

1.2.1 GFP小鼠皮膚成纖維細胞的分離

將GFP小鼠皮膚剪至2 mm×2 mm×2 mm大小，PBS振洗1遍；加入0．1%中性蛋白酶4℃消化過夜，無血清DMEM培養液清洗、終止消化，并揭去表皮層。余下的真皮組織以0．1%Ⅰ型膠原酶，37℃恒溫振蕩消化，分3個階段收獲成纖維細胞（間隔分別為2 h，4 h，8 h）。消化產物以150目尼龍篩過濾，細胞懸液1 000 r/min離心5 min，棄上清。加入PBS振蕩混勻，1 000 r/min離心5 min，棄上清。取少量細胞懸液用4%乙酸等體積稀釋破壞紅細胞，加入臺盼藍(Trypan Blue)進行拒染試驗，證實活細胞占總數的85%以上，用血球記數板對活細胞量進行計數后，用于實驗。

1.2.2 GFP小鼠成纖維細胞接種、培養、觀察和擴增

將最終獲得的成纖維細胞置DMEM培養液（10%FCS，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素）中混勻，以1×104cells/cm2的密度接種于培養皿，37℃恒溫培養箱（5%CO2）內培養，每3天換液1次，細胞長至85%融合后傳代。

1.2.3 GFP小鼠成纖維細胞收集

收集第3代細胞作為種子細胞。PBS稀釋至20×106cells/mL,以備注射用。

1.2.4 動物分組

共16只裸鼠。其中1只設為對照，另15只裸鼠隨機分為5組，每組3只，分別于細胞注射后1周、2周、3周、6周及12周進行檢測。

1.2.5 動物麻醉

整個實驗過程中，實驗動物均以10%水合氯醛0．3～0．35 mL/Kg腹腔注射進行麻醉。

1.2.6 GFP小鼠成纖維細胞裸鼠皮下注射

因裸鼠身體皮膚太薄，皮下過于疏松，故本實驗選擇裸鼠頭皮部注射，用1 mL注射器抽取細胞液，30G BD注射針頭注射，每個注射點注射0．15 mL，細胞盡量注射到頭皮與顱骨之間全層（圖1)，共注射15只裸鼠。

1.3 檢測

1.3.1 活體動物可見光成像儀定性及定量檢測

分別于細胞注射后1周、2周、3周、6周及12周，將各組裸鼠麻醉后，對每只裸鼠頭部進行活體熒光掃描（激發光波長530 nm），檢測GFP小鼠成纖維細胞注射后在體內的分布情況，并采集熒光成像圖，以未予任何細胞注射的裸鼠頭部作空白對照。通過尼康NIS-Elements BR 3．0圖像分析處理軟件，計算熒光信號強度值，并定量分析熒光信號分布趨勢，繪制柱狀圖。

1.3.2 取材

分別于細胞注射后1周、2周、3周、6周及12周取材。分別取兩眼之間及其兩側1 cm范圍內全層頭部皮膚組織，分兩部分。其中1/2皮膚入10%中性福爾馬林溶液固定，以行石蠟包埋切片；另1/2皮膚入液氮，以行OCT包埋，冰凍切片（圖1）。

1.3.3 冰凍切片的制備、染色

標本放入液氮，OCT包埋，冰凍切片機切片，厚度約8 μm。每個標本切2張。一張切片封片劑封片后，直接于熒光顯微鏡下觀察，同一視野下拍攝熒光照片，DAPI照片，以示蹤注射的GFP小鼠成纖維細胞。另一張切片用HE快速染色法染色。以熒光、DAPI照片為參照拍攝HE照片，以便確定熒光所在組織層次。

1.3.4 GFP蛋白的免疫組化檢測[3]

石蠟切片脫蠟，通過免疫組織化學技術檢測GFP小鼠成纖維細胞內的GFP蛋白，以便確定注射的成纖維細胞的存在。

1.4 統計學分析

采用SPSS 17．0軟件包對各組定量數據進行統計學分析。

2 結果

2.1 GFP小鼠皮膚成纖維細胞生長和形態學觀察

GFP小鼠皮膚成纖維細胞在DMEM全培養液中單層培養，剛貼壁時呈三角形，隨著生長時間延長而呈梭形和紡錘形（圖2）。

2.2 活體熒光成像結果

2.2.1 熒光成像觀察結果

分別于細胞注射后1周、2周、3周、6周及12周，將各組裸鼠麻醉后，對每只鼠頭部進行活體熒光掃描并采集熒光成像圖（圖3）。直接觀察結果表明：隨著時間的推移，熒光面積逐漸減小，熒光強度逐漸減弱，第12周仍有熒光存在，和陰性對照比較，提示有少量細胞存活。

2.2.2 活體熒光信號定量分析

通過熒光檢測儀獲得定量的灰度值，分析表明第1周熒光強度最強，第2周開始大幅減弱，并隨時間推移，熒光強度逐漸減弱，但第12周仍有一定的熒光強度，表明有少量的GFP小鼠皮膚成纖維細胞存活。統計學分析表明，熒光灰度值第1周與第2周、第3周、第6周及第12周均有顯著差異（P＜0．01）；第2周和第3周無統計學差異（P＞0．05）；第2周和第6周、第12周有統計學差異（P＜0．05）；第3周和第6周無統計學差異（P＞0．05）；第3周和第12周有統計學差異（P＜0．05）；第6周和第12周也無統計學差異（P＞0．05）（圖4）。

圖3 注射GFP小鼠成纖維細胞后不同時間活體熒光成像結果Fig.3 Living fluorescence imaging at different time after injection

2.3 冰凍切片熒光顯微鏡觀察

結果表明，第1、2周可明顯發現注射部位GFP成纖維細胞發出的綠色熒光，主要集中在皮下肌肉交界處。第3、6周仍可發現少量熒光 ，第12周僅能發現極少量細胞呈現綠色熒光（圖5）。

2.4 GFP蛋白免疫組化染色

結果表明，第1、2周可明顯發現注射部位GFP蛋白的存在，第3周可發現注射部位少量GFP蛋白的存在，第6周、12周僅能發現極少量GFP蛋白的存在（圖6）。

圖4 每組裸鼠頭部活體熒光檢測的灰度強度均值Fig.4 Mean grey level of living fluorescence imaging at different groups

圖5 不同時間點取材冰凍切片熒光顯微鏡觀察結果（100×）Fig.5 The distribution and survival of GFP-labeled fibroblasts at different time under the fluorescence microscope(100×)

圖6 不同時間點取材石蠟切片GFP免疫組化染色結果（100×）Fig.6 GFP immunohistochemistry of GFP-labeled fibroblasts at different time

3 討論

傳統的研究細胞轉歸的方法[4]是標記移植細胞，然后檢測其標記物。傳統標記細胞的方法在研究細胞轉歸時存在局限性。

使用胞漿標記物，常用的主要有Hoechst、Dil等熒光色素細胞移植前用熒光素進行預先標記，移植后可以利用熒光顯微鏡觀察熒光標記細胞的存活和遷移情況，熒光色素已經被廣泛用于細胞的標記和追蹤方面的研究，但存在以下不足：①隨著細胞的分裂，標記物也幾乎等份地分配給兩個子細胞，子細胞的熒光強度也隨之下降；②只能靠觀察到的熒光判斷細胞的存在，而難以觀察細胞形態及存活狀態。

使用核酸標記物，常用的有胸腺嘧啶同位素標記、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)標記等，是反映細胞增殖及跟蹤監測移植細胞的理想指標，但標記準確性及標記率存在差異。標記細胞如果發生凋亡或死亡，其釋放的BrdU則可滲入到處于細胞循環S期的任何細胞，從而難以區分移植細胞和宿主細胞，出現假陽性。

改變細胞基因使其表達特異性的標志物，但經過基因修飾的細胞遺傳特性并不穩定，可能在分析正?；驅ψ哟毎只较驎r產生影響，或在移植后生成腫瘤。

由于傳統標記細胞方法的局限性，本研究選擇了綠色熒光蛋白轉基因小鼠的皮膚成纖維細胞作為研究對象，綠色熒光蛋白轉基因小鼠其細胞可以正常培養，分裂擴增，其細胞活力不受細胞標記物的影響，其細胞內均含GFP蛋白，細胞熒光不會隨細胞分裂而衰減，其熒光不會隨時間而減弱，其死亡后代謝消失，不易出現假陽性。

檢測細胞存在的手段很多，受影響的因素也很多，單一檢測會存在假陽性或假陰性，本研究采用了多種檢測手段相結合的方法，以避免上述結果的出現。

活體動物可見光成像儀器可以達到對活體熒光的定性和定量檢測，不易出現假陰性，注射部位有熒光，而非注射部位無熒光，可清晰表明注射部位細胞的存活情況及存活量。GFP蛋白質本身發光，冰凍切片熒光顯微鏡下直接觀察注射細胞后熒光的存在，容易出現假陽性，如果切片沒有切到注射部位，也可能出現假陰性。GFP小鼠成纖維細胞內含GFP蛋白質，通過免疫組織化學技術，在裸鼠頭皮的注射細胞部位，檢測GFP小鼠成纖維細胞內的GFP蛋白，以便確定注射的成纖維細胞的存在。免疫組化同樣也存在假陽性和假陰性。

故本研究以GFP小鼠成纖維細胞為研究對象，將3種方法相結合，以提高研究結果的準確性，為細胞體內轉歸的研究提供了一種有效的手段。

目前自體成纖維細胞注射除皺在歐洲廣泛應用于臨床，美國也進入3期臨床。其特點是對細紋、淺紋、痤瘡后凹陷性瘢痕治療效果較好，對深皺紋和面部凹陷的治療效果不盡人意。

本研究結果顯示，皮膚成纖維細胞皮下局部注射后2周內明顯存在，12周后僅有少量細胞存活，故單純皮下注射成纖維細胞，并依賴其存活，從而達到除皺的效果是十分有限的。而注射自體成纖維細胞，對細紋、淺紋、痤瘡后凹陷性瘢痕產生較好效果可能是由于多次創傷刺激組織增生而達到的。

組織工程[5－6]是應用細胞生物學和工程學的原理，研究和開發用于修復和改善人體各種組織或器官損傷后功能和形態的一門新興學科，核心就是建立細胞與生物材料的三維空間復合體，即具有生命力的活體組織，用以對病損組織進行形態、結構和功能的重建并達到永久性替代。根據組織工程研究發現[7－8]，沒有和生物材料的結合，單純細胞注射皮下成活量有限，且無法形成具有三維結構的組織，產生除皺的填充效果。而和生物支架材料相結合，細胞存活率明顯提高，并可再生新的三維組織。為了提高本研究中成纖維細胞的成活率，及除皺時的填充效果，下一步可以將成纖維細胞和可降解的生物材料結合進行進一步研究。

[1] Homicz MR,Watson D.Review of injectable materials for soft tissue augmentation[J].Facial Plast Surg,2004,20(1):21-29.

[2] Watson D,Keller GS,Lacombe V,et al.Autologous fibroblasts for treatment of facial rhytids and dermal depression[J].Arch Facial Plast Surg,1999,1(3):165-167.

[3] Matsuo S,Kurisaki A,Sugino H,et al.Analysis of skin graft survival using green fluorescent protein transgenic mice[J].Med Invest, 2007,54(3-4):267-275.

[4] 金旭紅,楊柳.骨髓間充質干細胞標記及活體示蹤技術研究進展[J].中華創傷雜志,2007,23(4):311-313.

[5] Boss WK Jr,Usal H,Chernoff G.Autologous cultured fibroblasts as cellular therapy in plastic surgery[J].Clin Plastic Surg,2000,27 (10):613-626.

[6] Boss WK Jr,Usal H,Fodor PB,et al.Autologous cultured fibroblasts: a protein repair system[J].Ann Plast Surg,2000,44(5):536-542.

[7] 張滌生.組織工程學簡介[J].中華整形燒傷外科雜志,1998,14(3): 211-214.

[8] Langer R,Vacanti JP.Tissue engineering[J].Science,1993,260 (5110):920-926.

Research on prognosis of fibroblast after injection In vivo

DING Xiaobang,WANG Jian,CAO Yilin.

Plastic Surgery Hospital,Peking Union Medical College,Chinese Academy of Medical Science,Beijing 100144,China.Corresponding author:Cao Yilin(E-mail:Yilincao@yahoo.com).

Objective To investigate the prognosis of mouse C57BL/6-GFP fibroblast after injection in vivo.Methods Fibroblasts were derived from Green Fluorescent Protein(GFP)transgenic mice.The 3rdpassage of fibroblasts were harvested and injected subcutaneously into the scalp of nude mice with density of 20×106cells/mL.Night OWL LB983 imaging system, fluorescence microscope,histological examination and GFP immunohistochemistry were used to investigate the prognosis of the fibroblasts around the injection area at 1,2,3,6 and 12 week after injection.Results Large amount of fibroblasts were observed 2 weeks after injection,less fibroblasts were observed 3 weeks after injection and only a few fibroblasts were found 12 weeks after injection.As time went by,a few fibroblasts could be detected.Conclusion The fibroblast injection is not indication for facial rejuvenation.

Green Fluorescent Protein;Fibroblast; Hypodermic injection;Prognosis

Q813.1+2

A

1673－0364（2011）04－0181－05

2011年6月16日；

2011年7月21日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.05.001

北京市科委科技計劃重大項目（D090800046609003），衛生部部屬醫院臨床學科重點項目,國家自然科學基金青年科學基金項目 (30801192)，北京市自然科學基金（7102134），高等學校博士學科點專項科研基金（新教師基金課題, 200800231078）。

100144 北京市 北京協和醫學院,中國醫學科學院整形外科醫院。

曹誼林（E-mail:yilincao@yahoo.com）。