脂肪基質血管成分移植促進隨意皮瓣成活的實驗研究

盛玲玲 杜子婧 李華 李慧婕 周達 李青峰

脂肪基質血管成分移植促進隨意皮瓣成活的實驗研究

盛玲玲 杜子婧 李華 李慧婕 周達 李青峰

目的探討脂肪基質血管成分（Stromal vascular fraction，SVF）移植是否可以促進隨意皮瓣成活，及其作用的相關機制。方法分離4周齡Wistar大鼠脂肪中的SVF及骨髓中的單個核細胞（BM-MNCs），RT-PCR檢測VEGF和bFGF在兩種細胞中的表達。根據移植細胞的不同，將24只Wistar大鼠分成3組，分別為對照組、BM-MNCs組和SVF組。在大鼠背部設計一個10 cm×3 cm大小的矩形皮瓣，分別將含有5×107個SVF及BM-MNCs的混懸液各1 mL均勻注射至皮下組織層，對照組單純注射1 mL PBS。2 d后，皮瓣掀開原位縫合，術后7 d統計皮瓣的成活率。取各組皮瓣相同部位的組織，實時定量PCR檢測組織中VEGF和bFGF基因的表達。結果SVF和BM-MNCs細胞中VEGF和bFGF的表達無明顯差別（P＞0.05）。皮瓣原位縫合后7 d，SVF組和BM-MNCs組皮瓣的成活率分別為（72.2±2.0）%和（76.4±3.1）%，均明顯高于對照組的（56.8±4.6）%（P＜0.05）。實時定量PCR檢測發現SVF組和BM-MNCs組皮瓣組織中VEGF和bFGF基因的表達明顯升高。結論SVF移植入皮瓣后可以通過旁分泌生長因子如VEGF和bFGF等增加皮瓣的成活面積。

脂肪基質血管成分隨意皮瓣血管化

骨髓單個核細胞（Bone marrow-derived mononuclear cells,BM-MNCs）已被證實可以通過促進隨意皮瓣的毛細血管新生而提高皮瓣的成活率[1]。BMMNCs是骨髓中的異質性細胞群體，分離后無需培養即可直接應用。但是，骨髓抽吸是有創的，給病人帶來極大的痛苦，使得BM-MNCs的臨床應用受限。脂肪基質血管成分（Stromal vascular fraction，SVF）是膠原酶消化脂肪后獲得的含有脂肪干細胞的細胞群體，如同BM-MNCs，SVF分離后也無需培養即可應用。脂肪在人體中的存儲量大，脂肪抽吸對組織損傷小，可反復抽取。因此，獲取大量的SVF是非常容易的。SVF成為細胞治療的新選擇，極有可能被應用于臨床。目前，SVF已成功應用于缺血組織的血管化治療，如缺血心肌[2]、缺血下肢[3-4]，取得了滿意的效果，但是尚無SVF應用于隨意皮瓣缺血治療的研究。本實驗旨在觀察SVF是否可以促進隨意皮瓣成活，并探討其相關機制。

1 材料和方法

1.1 材料

Wistar大鼠（上海斯萊克實驗動物有限公司）；Ⅱ型膠原酶（Sigma公司，美國）；培養基（Gibco公司，美國）；PCR試劑盒（Invitrogen公司，美國）；MX3000P熒光定量PCR儀（Stratagene公司，美國）。1.2細胞的分離

1.2.1SVF的分離

4周齡Wistar大鼠麻醉處死后，在無菌條件下分離獲得腹股溝脂肪墊。剪碎后，加入適量0.2%Ⅱ型膠原酶，于37℃搖床振蕩1 h。膠原酶消化結束后，加入相同量的含10%胎牛血清的培養基終止膠原酶的作用。離心收集沉淀后，加入紅細胞裂解液（Sigma公司，美國），于37℃溫箱中裂解5 min。過濾后離心收集所得沉淀，即為SVF。

1.2.2BM-MNCs的分離

大鼠處理同上。分離出股骨和脛骨后，用注射器吸取其中的骨髓，用Percoll液（Sigma公司，美國）密度梯度離心收集骨髓中的單個核細胞，即為BMMNCs。

1.3RT-PCR檢測VEGF和bFGF基因在SVF和BM-MNCs細胞中的表達

分別收集3×106個SVF和BM-MNCs，Trizol-氯仿抽提，異丙醇沉淀，乙醇洗滌，獲得細胞RNA的混懸液。測OD值后定量反轉錄成cDNA。PCR擴增后凝膠電泳顯示目的基因的條帶。所用血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF）及內參β-actin的基因引物序列見表1。

1.4 細胞移植及動物實驗

細胞計數后，分別將5×107個SVF及BMMNCs重懸于1 mL PBS中備用。

實驗動物禁食8 h后，3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，俯臥位固定，在大鼠背部設計10 cm×3 cm的隨意型皮瓣，皮瓣蒂部平于髂后上棘連線。根據移植細胞的不同，將24只（體重約200 g）的Wistar大鼠隨機分成3組，每組8只，分別為對照組、BMMNCs組和SVF組。分別將含有SVF及BM-MNCs的混懸液1 mL均勻注射至皮下組織層，對照組單純注射1 mL PBS。2 d后，掀起皮瓣，保留皮瓣下的肉膜層。結扎創面活躍出血點，皮瓣原位縫合。

1.3 皮瓣成活率測定

皮瓣術后7 d，肉眼觀察皮瓣成活情況并測定皮瓣成活率。皮瓣壞死的標準為：皮膚顏色變黑、組織回縮、彈性差、切割不出血。拍照后圖像輸入計算機，應用IPP 6.0圖像分析系統，計算出皮瓣成活率。

1.4SYBR GreenⅠ實時定量PCR檢測皮瓣組織中VEGF和bFGF的表達

無菌條件下取各組皮瓣（n＝3）壞死界線旁開1 cm處的組織，勻漿后提取RNA，反轉錄為cDNA。按照定量PCR試劑盒分別加樣后，PCR反應在MX3000P Real Time PCR儀上進行，采用β-actin作為內參（各引物序列見表1）。根據反應產物的溶解曲線，數據經MX3000P Corparative Quantitative軟件進行自動定量分析。

表1VEGF、bFGF及內參β-actin的基因引物Table 1Primers sequences of VEGF,bFGF and β-actin genes

1.5 統計學分析

數據均采用均數±標準差表示，用SPSS 13.0軟件對數據進行方差分析，兩兩之間的比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1VEGF和bFGF基因在SVF和BM-MNCs的表達

RT-PCR檢測脂肪基質血管成分及骨髓單個核細胞的VEGF和bFGF的表達，發現在內參β-actin表達相近的情況下，SVF和BM-MNCs兩者之間的VEGF、bFGF的表達無明顯差別（圖1）。

圖1 術后7 d各組皮瓣成活情況及成活率統計（箭頭指示壞死界限；＊：P＜0.05）Fig.1Flap survival of the three groups and statistic analysis 7 days after surgery(Arrows show the necrosis boundaries;*:P＜0.05)

2.2 皮瓣成活率統計

皮瓣壞死區域與成活區域的界線明顯，SVF組的皮瓣成活率為（72.2±2.0）%，BM-MNCs組的皮瓣成活率為（76.4±3.1）%，均高于對照組（56.8±4.6）%，差異有統計學意義（P＜0.05）；SVF組和BM-MNCs組之間無明顯差別（P＞0.05）（圖2）。

圖2 各組皮瓣組織vWF免疫組化染色（箭頭所指為毛細血管；＊：P＜0.05；100×）Fig.2Anti-vWF staining of the flap tissues (Arrows show capillaries;*:P＜0.05;100×)

2.3VEGF和bFGF基因在各組皮瓣組織中的表達

收集各組皮瓣組織后，實時定量PCR檢測獲取各組基因的Ct值，采用2-△△Ct的方法，將對照組的基因表達校正為1倍量。結果發現VEGF和bFGF在SVF移植組和BM-MNCs移植組皮瓣組織中的表達明顯上調，與對照組的差異顯著（圖3）。

圖3 各組皮瓣組織VEGF和bFGF表達情況（＊：P＜0.05）。Fig.3Gene expression levels of VEGF and bFGF in flap tissues of different groups(*:P＜0.05)

3 討論

皮瓣轉移修復是整形外科的常用技術，常用來修復因創傷、腫瘤切除等引起的組織缺損。皮瓣自身的低氧環境雖然可以促進其血管化，但是不足以平衡缺血、缺氧帶來的組織損傷，導致皮瓣遠端發生缺血性壞死。如果能在術前實現皮瓣的血管化，則有望大大降低壞死面積。

血管化主要包括血管新生和血管形成[5-6]。血管新生是在原來存在的血管結構上長出新血管的生物學過程。血管形成是指內皮祖細胞遷移至某部位，分化發育為新血管。血管化過程主要是受多種生長因子的調節。單獨應用VEGF、bFGF已被證明可以促進隨意皮瓣血管化，提高成活率[7－8]。但是生長因子的應用受限于其單一性及在體內較短的半衰期。干細胞移植治療可望解決了這一問題，植入體內的干細胞可持續分泌多種促血管化生長因子，從而發揮比單純生長因子更持久、更有效的作用。

骨髓單個核細胞促進皮瓣成活的作用可能與移植入體內的細胞持續分泌生長因子，如VEGF和bFGF有關[1]。本實驗檢測了這兩種基因在SVF和BM-MNCs的表達，發現VEGF和bFGF在這兩種細胞群中的表達差異不大。由于VEGF和bFGF是目前公認的與促血管化作用關系最密切的兩種生長因子[9]，此結果在一定程度上表明在皮瓣的缺血治療中，SVF有可能發揮同BM-MNCs一樣的效果。其中，bFGF主要是在血管再生的早期起作用，bFGF能誘導內皮祖細胞和內皮細胞的活化，可能起啟動血管再生的作用[10]。而VEGF則是在血管化后期調節內皮細胞的增殖和分化[10]，VEGF還可以抑制低氧環境中內皮細胞的凋亡[11]，趨化周圍組織和骨髓中的干細胞至缺血部位[12]。

本實驗中，SVF和BM-MNCs移植入皮瓣后都能明顯提高皮瓣的成活率，兩組之間的效果無明顯差別，但與對照組之間都存在顯著性差異，與Sumi等[3]的實驗結果相符。Sumi等將小鼠的SVF和BMMNCs移植入缺血下肢中，使得缺血下肢的血流強度、血管的數量顯著增強，下肢組織成活率明顯高于對照組，SVF組和BM-MNCs組之間無差別。

目前關于細胞移植的治療性血管化作用的機理集中于植入細胞的直接分化和持續分泌多種生長因子。但是，細胞移植入體內后成活率極低[12-13]，其分化的細胞不足以促進血管化的發生。因此，其持續的旁分泌能力被認為是發揮促血管化作用的主要機理。在本實驗中，VEGF、bFGF在植入SVF和BMMNCs的皮瓣組織中表達明顯上調，這可能是SVF和BM-MNCs直接分泌VEGF、bFGF的結果，也是促進皮瓣成活的主要原因。

有學者認為，BM-MNCs和SVF作為異質性細胞群體，在血管化過程中，細胞群體中的各種細胞可以發揮協調作用，從而發揮著比同質性干細胞群更大的作用[14]。另外，SVF和BM-MNCs的應用還可以減少獲取同質性干細胞所需的體外培養時間（一般為2～3周），避免了長時間體外培養引發的干細胞分化和突變[15]。

通過本實驗研究發現SVF移植可以通過旁分泌VEGF、bFGF等發揮促進皮瓣血管化的作用，從而減少皮瓣的壞死面積，效果與BM-MNCs移植無明顯差異。隨著對SVF認識的逐步加深，SVF將有望被廣泛應用于皮瓣缺血的治療。

[1]Yang M,Sheng L,Li H,et al.Improvement of the skin flap survival with the bone marrow-derived mononuclear cells transplantation in a rat model[J].Microsurgery,2010,30(4):275-281.

[2]Leobon B,Roncalli J,Joffre C,et al.Adipose-derived cardiomyogenic cells:in vitro expansion and functional improvement in a mouse model of myocardial infarction[J].Cardiovasc Res,2009,83(4): 757-767.

[3]Sumi M,Sata M,Toya N,et al.Transplantation of adipose stromal cells,but not mature adipocytes,augments ischemia-induced angiogenesis[J].Life Sci,2007,80(6):559-565.

[4]Miranville A,Heeschen C,Sengenes C,et al.Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells[J].Circulation,2004,110(3):349-355.

[5]Tepper OM,Galiano RD,Kalka C,et al.Endothelial progenitor cells:the promise of vascular stem cells for plastic surgery[J]. Plast Reconstr Surg,2003,111(2):846-854.

[6]Asahara T,Murohara T,Sullivan A,et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis[J].Science,1997,275 (5302):964-967.

[7]Zhang F,Oswald T,Lin S,et al.Vascular endothelial growth factor (VEGF)expression and the effect of exogenous VEGF on survival of a random flap in the rat[J].Br J Plast Surg,2003,56(7):653-659.

[8]Fujihara Y,Koyama H,Ohba M,et al.Controlled delivery of bFGF to recipient bed enhances the vascularization and viability of an ischemic skin flap[J].Wound Repair Regen,2008,16(1):125-131.

[9]Ferrara N,Alitalo K.Clinical applications of angiogenic growth factors and their inhibitors[J].Nat Med,1999,5(12):1359-1364.

[10]張富貴,李權.帶蒂皮瓣新生血管化機制中相關生長因子的作用[J].國際口腔醫學雜志,2009,36(2):231-234.

[11]Weng R,Li Q,Li H,et al.Mimic hypoxia improves angiogenesis in ischaemic random flaps[J].J Plast Reconstr Aesthet Surg,2010, 63(12):2152-2159.

[12]Wu Y,Chen L,Scott PG,et al.Mesenchymal stem cells enhance wound healing through differentiation and angiogenesis[J].Stem Cells,2007,25(10):2648-2659.

[13]Noiseux N,Gnecchi M,Lopez-Ilasaca M,et al.Mesenchymal stem cells overexpressing Akt dramatically repair infarcted myocardium and improve cardiac function despite infrequent cellular fusion or differentiation[J].Mol Ther,2006,14(6):840-850.

[14]Taylor DA,Zenovich AG.Cardiovascular cell therapy and endogenous repair[J].Diabetes Obes Metab,2008,10(4):5-15.

[15]Qin Y,Ji H,Wu Y,et al.Chromosomal instability of murine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells in long-term culture and development of cloned embryos[J].Cloning Stem Cells,2009,11 (3):445-452.

Effect of Stromal Vascular Fraction Transplantation on Improvement of Random Skin Flap Survival

ObjectiveTo investigate effect of SVF transplantation on survival of random skin flap and explore the relative mechanism.MethodsSVF and bone marrow-derived mononuclear cells(BM-MNCs)were isolated from 4-week-old Wistar rats.The gene expressions of VEGF and bFGF in SVF and BM-MNCs were detected by RT-PCR.Twenty-four Wistar rats were selected to make 10 cm×3 cm skin flap at back,and were randomly divided into 3 groups according to different suspension fluid which were injected subcutaneously to treat flaps(n＝8):control group,BM-MNCs group and SVF group. Two days later,the flap was raised and sutured.Seven days after the operation,the survival of skin flap in 3 groups was observed.A piece of flap at same place was taken and quantitative expression of VEGF and bFGF was detected by quantitative PCR.ResultsThe expressions of VEGF and bFGF were same in SVF and BM-MNCs.The survival ratio of skin flap in BM-MNCs group(76.4±3.1)%and SVF group(72.2±2.0)%were both obviously higher than the control group(56.8±4.6)%, P＜0.05.The expression of VEGF and bFGF in BM-MNCs and SVF groups was distinctly higher than the control group. ConclusionSVF can improve the viability of skin flap by the para-secreting of VEGF and bFGF.

Stromal vascular fraction;Random skin flap;Neovascularization

R622

A

1673－0364（2011）03－0143－04

SHENG Lingling,DU Zijing,LI Hua,LI Huijie,ZHOU Da,LI Qingfeng.
Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:LI Qingfeng(E-mail:liqfliqf@yahoo.com.cn).

2011年3月29日，

2011年4月18日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.03.006

國家自然科學基金項目（30730092，30925034）、國家杰出青年科學基金（30925034）、上海市曙光計劃基金（09CG14）。

200011上海市上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院整復外科。

李青峰（E-mail：liqfliqf@yahoo.com.cn）。