人類Gfi1基因SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測方法的建立

黃 敏，歐東梅，徐金環(huán)，張曉梅，張義成

(1、華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院檢驗科，湖北 武漢 430030；2、廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院神經(jīng)內科，廣東 廣州；3、華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院血液科)

獨立生長因子Gfi1是一種鋅指阻遏子，其位點是最常見的逆轉錄病毒插入位點之一[1]，在與Pim-1或Myc的共同作用下可顯著加速T細胞淋巴瘤的發(fā)展[2]，我們采用SYBR GreenⅠ染料法通過建立實時熒光定量PCR的標準品質粒繪制標準曲線用于檢測Gfi1mRNA的表達，實現(xiàn)樣品拷貝數(shù)的準確定量。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 大腸桿菌E.coli DH5ɑ由本室保存；含有目的基因Gfi1cDNA的真核表達質粒plox-Gfi1由本室構建，Gfi1cDNA兩端帶有BamHⅠ酶切位點。

1.2試劑 限制性內切酶BamHⅠ為大連寶生物公司；胰蛋白胨和酵母提取物為英國Oxoid公司；Taq酶為 Fermentas公司；SYBR Green I for real-time PCR液為日本TOYOBA公司；質粒小量提取純化試劑盒為北京博大泰克生物基因技術有限責任公司。

1.3 儀器 ABI公司stepone熒光定量PCR儀；美國Biometra公司4800型PCR擴增儀；美國Beckman公司DU70型紫外分光光度儀；Alpha Innotech凝膠電泳分析系統(tǒng)。

1.4 目的片斷引物的設計、合成 應用軟件oligo6.0，根據(jù)GenBank收錄的Gfi1mRNA全序列NM005263進行設計，引物跨越內含子，避免基因組污染影響結果，目的片斷Gfi1長度為176bp，引物由上海博道生物技術公司合成。引物序列：上游引物：5＇-AGACCCTTTGCCTGCGAGATGTGC-3＇，下游引物：5＇-TAGGGCCGAGTGTCTGAGTGGATA-3＇。用無菌雙蒸水將引物配制成100pmol/μl的儲存液-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 目的基因Gfi1cDNA質粒plox-Gfi1的鑒定 質粒plox-Gfi1經(jīng)BamHⅠ酶切和PCR擴增及測序鑒定。 酶切反應體系①10×緩沖液：2μl； ②plox-Gfi1：5μl；③BamHⅠ酶：1μl；④加滅菌蒸餾水至 20μl。酶切反應條件：37℃酶切2h。PCR鑒定上下游引物分別 是 5＇-CTGGATCCCCATGCCGCGCTCATTTCTCG TCA AAAG-3＇；5＇-GCGGATCCTCATTTGAGCCCAT GC TGCGTCTCCCGGTG-3＇。 PCR 體系為：①5×Taq緩沖液：5μl； ②MgCl2：3μl ； ③dNTP(10mmol/L)：0.5μl；④plox-Gfi1 質粒 DNA 模板 ：1μl；⑤上游引物(10pmol/μl)：1μl；⑥下游引物(10pmol/μl)：1μl；⑦Taq酶 ：1.5μl；⑧加滅菌蒸餾水至 50μl。 PCR 反應條件：預變性 95℃ 5min，變性 94℃ 30s，退火 55℃1min，延伸72℃ 2min，共35個循環(huán)，循環(huán)后 72℃延伸10min。將酶切和PCR鑒定正確的的克隆送上海博道生物技術有限公司進行序列分析。

1.6 標準品質粒拷貝數(shù)的換算 小量抽提純化質粒plox-Gfi1，按1:100的稀釋度在紫外分光光度計中測定260nm和280nm的OD值，得出質粒濃度為0.845μg/μl，根據(jù)公式[質粒濃度(g/μl)/(660×質粒長度 bp)]×6.022×1023(copies/μl)換算為 6.36×109copies/μl。

1.7 標準曲線和熔解曲線的建立 以6.36×109copies/μl的質粒為母液，連續(xù)10倍梯度稀釋成6.36×102～6.36×108copies/μl的梯度濃度標準品， 采用SYBR Green I熒光定量PCR法對以上七個稀釋梯度的標準品質粒模板進行擴增。定量PCR反應體系包括： ①2×SYBR GreenⅠ液：5μl； ②上游引物(10pmol/ul)：0.2μl；③下游引物(10pmol/μl)：0.2μl；④標準品質粒DNA模板：1μl； ⑤加滅菌蒸餾水至10μl。擴增條件為： 95℃預變性 1 min，95℃變性15s，60℃退火 15s，72℃延伸 45s，共 40 個循環(huán)，在每個循環(huán)的延伸末檢測熒光信號。隨著PCR儀在每個循環(huán)結束后測定的吸光值就得到了以標準品濃度的對數(shù)值為橫坐標，Ct值為縱坐標的標準曲線。反應結束后進行熔解曲線分析，95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s，每隔0.3℃測定吸光值。這樣就得到了PCR產物的熔解曲線，以了解反應的特異性，保障測定的結果的準確可靠。

1.8 電泳檢測PCR擴增產物 為了驗證SYBR GreenⅠ染料方法的特異性，我們將擴增產物在25g/L瓊脂糖凝膠中進行電泳。一旦PCR產物的長度正確并未見雜帶，則僅用實時定量PCR熔解曲線中的熔解溫度(Tm)監(jiān)測反應特異性即可。

1.9 標準品穩(wěn)定性與重復性 將每個梯度的標準品平行操作5次和在5d內分別測定，計算Ct平均值、標準差，獲取其批內變異系數(shù)和批間變異系數(shù)，比較同一濃度、同一次反應不同反應管間的批內變異及不同時間反應結果的批間變異。

2 結果

2.1 質粒plox-Gfi1鑒定

重組質粒plox-Gfi1經(jīng)BamHⅠ單酶切及PCR擴增后均獲得了符合預期大小的條帶(約1200bp)。將含重組質粒的陽性克隆送上海博亞公司自動測序儀進行測定,結果經(jīng)blast進行分析，顯示插入片斷序列與基因庫收錄的Gfi1 (收錄號NM005263)一致。

2.2 Gfi1質粒標準曲線的建立

圖1 實時熒光定量PCR擴增曲線

當質粒 DNA 濃度在 6.36×102～6.36×108copies/μl范圍時，曲線為一組典型的倒S型曲線(圖1)，模板濃度越高，循環(huán)閾值越小，各梯度起始模板拷貝濃度與循環(huán)閾值之間呈良好的線性關系。隨循環(huán)數(shù)的增加，熒光信號逐漸增強，而當循環(huán)數(shù)達到一定程度時，熒光強度達到平臺。以標準品稀釋滴度的對數(shù)值為橫坐標，以循環(huán)閾值為縱坐標建立實時定量PCR的標準曲線 (圖2)，其線性回歸方程為y=-3.441x+40.314，y為Ct值，x為待測樣品濃度的對數(shù)值，標準曲線斜率為-3.441，γ2=0.996。

圖2 實時熒光定量PCR標準曲線

2.3 實時熒光擴增熔解曲線

圖3 標準品質粒plox-Gfi1熔解曲線

根據(jù)所得的熔解曲線(圖3)，在90℃左右出現(xiàn)單一的熔解峰，曲線平穩(wěn)，峰尖且窄，提示各濃度質粒熔解溫度均一，擴增產物特異性好，以此為基礎進行定量是可靠的。

2.4 方法的特異性與靈敏度

將PCR產物用25g/L瓊脂糖凝膠電泳在176 bp處獲得一條帶，未發(fā)現(xiàn)明顯的雜帶，熒光定量PCR反應線性范圍廣，可達7個log值的范圍(6.36×102～6.36×108)，敏感性高，起始拷貝數(shù)在 6.36×102就可獲得良好的定量效果。為對樣品進行準確定量奠定了良好的基礎。而采用常規(guī)PCR檢測標準品的起始拷貝數(shù)為 6.36×104copies/μl(圖 4)。

圖4 標準品質粒plox-Gfi1常規(guī)PCR擴增電泳結果

2.5 穩(wěn)定性與重復性

將 7 個不同稀釋度(6.36×108～6.36×102copies/ml)的標準品同批次各重復5管檢測，得其批內CV%為1.35%～3.61%。將上述7個標準品分5批次在不同時間進行檢測，得其批間CV%為1.49%～3.42%(表1)。表明標準品及該實驗體系具有較好的穩(wěn)定性和重復性。

表1 標準品質粒plox-Gfi1穩(wěn)定性與重復性評價

3 討論

Gfi1在人類基因組定位于染色體1p22，其羧基端含有6個C2H2的鋅指DNA結構域，氨基端含有由20-氨基酸組成的SNAG結構域，SNAG是高度保守的，主要發(fā)揮核定位和轉錄阻遏作用[3]。Gfi1可以使T細胞系不依耐IL-2就能生存從而在小鼠T細胞淋巴瘤形成中發(fā)揮重要作用[4]。近來有研究表明MDS伴外周血低白細胞的患者Gfi1基因在mRNA水平的表達是降低的[5]，但是Gfi1mRNA在其它惡性血液病中絕對表達量的情況國內尚無報道。

實時熒光定量PCR是一種在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。本實驗采用SYBR GreenⅠ染料法通過建立質粒標準品繪制標準曲線來實現(xiàn)Gfi1基因的絕對定量。SYBR greenⅠ是一種不對稱箐類熒光素，非特異地嵌合在DNA雙螺旋結構的小溝內，與雙鏈DNA結合后，熒光大大增強，當它從DNA雙鏈上釋放出來時，熒光迅速下降。因此，SYBR GreenⅠ產生的熒光信號強度代表了雙鏈DNA的數(shù)量，從而實現(xiàn)對特異性產物的鑒別和定量[6]。但是SYBR GreenⅠ沒有特異性，對PCR反應中的非特異性擴增或引物二聚體也會結合產生熒光。如果結合熔解曲線，就能很好的判斷反應的特異性。

本實驗采用SYBR GreenⅠ法成功建立了檢測人Gfi1mRNA的實時熒光定量PCR標準曲線，公式為y=-3.441x+40.314，斜率為-3.441，相關系數(shù)為0.996，研究者們通過實踐總結提出斜率在-3.0～-3.9，相關系數(shù)＞0.95的標準曲線已是比較滿意的實驗結果[7]，每個梯度濃度的標準品質粒均呈現(xiàn)典型的S形動力學曲線，可見本實驗體系線性范圍廣，可達 7 個 log 值的范圍 (6.36×102～6.36×108copies/μl)，敏感性高，起始拷貝數(shù)在6.36×102copies/μl就可獲得良好的定量效果，而普通的PCR檢測至少要6.36×104copies/μl才能檢測得到。熔解曲線分析顯示在90℃左右有一單一的峰，峰的形狀銳利，說明引物的特異性好。為對樣品進行準確定量奠定了良好的基礎。

通過對標準品進行的重復性實驗，我們了解每個稀釋度標準品的Ct值基本恒定，批內和批間變異系數(shù)分別為1.35%～3.61%和1.49%～3.42%，說明本實驗體系有較好的重復性與穩(wěn)定性，而且采用重組質粒作為標準品可以長期穩(wěn)定保存，與目的基因同源性高，兩者擴增效率一致確保定量結果可靠。

本研究以plox-Gfi1質粒為模板，建立了SYBR GreenⅠ實時熒光PCR定量的實驗方法與反應體系，該法快速有效、靈敏度高、特異性好，Ct值線性范圍廣，可重復性好，為Gfi1基因的進一步研究提供了可靠手段。

[1]Gilks CB,Bear SE,Grimes HL,et al.Progression of interleukin-2(IL-2)-dependent rat T cell lymphoma lines to IL-2-independent growth following activation of a gene(Gfi-1)encoding a novel zinc finger protein[J].Mol Cell Biol,1993,13(3):1759-1768.

[2]Schmidt T,Karsunky H,Gau E,et al.Zinc finger protein GFI-1 has low oncogenic potential but cooperates strongly with pim and myc genes in T-cell lymphomagenesis[J].Oncogene,1998,17(20):2661-2667.

[3]Grimes HL,Chan TO,Zweidler-McKay PA,et al.The Gfi-1 protooncoprotein contains a novel transcriptional repressor domain,SNAG,and inhibits G1 arrest induced by interleukin-2 withdrawal[J].Mol Cell Biol,1996,16(11):6263-6272.

[4]Zornig M,Schmidt T,Karsunky H,et al.Zinc finger protein GFI-1 cooperates with myc and pim-1 in T-cell lymphomagenesis by reducing the requirements for IL-2[J].Oncogene,1996,12(8):1789-1801.

[5]Huh HJ,Chae SL,Lee M,et al.CD34,RAB20,PU.1 and GFI1 mRNA expression in myelodysplastic syndrome[J].Int JLab Hematol,2009,31(3):344-351.

[6]Yin JL,Shackel NA,Zekry A,et al.Real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR)formeasurement of cytokine and growth factor mRNA expression with fluorogenic probes or SYBR GreenⅠ[J].Immunol Cell Biol,2001,79(3):213-221.

[7]van der Velden VH,HochhausA,Cazzaniga G,et al.Detection of minimal residual disease in hematologic malignancies by real-time quantitative PCR:principles,approaches,and laboratory aspects[J].Leukemia,2003,17(6):1013-1034.