連續流Biohydrogenbacterium R3 sp.nov.菌株糖蜜廢水發酵產氫能力分析1)

白羽 蔡體久 韓偉 李永峰 劉海亮

(東北林業大學，哈爾濱，150040)

由于溫室效應等環境問題以及化石能源的日益短缺，世界范圍內都在尋求無污染、可再生的替代能源［1］。氫能具有高熱量(122 kJ/g)和無污染等優點而被認為是未來極具發展前景的可替代能源［2］。發酵法生物制氫技術是一種產生清潔燃料與廢物處理相結合的新技術，具有能源回收和廢物處理的雙重功效［3－4］，是解決未來能源問題的重要途徑［5］。提高產氫效率以及降低制氫成本是生物制氫工藝產業化發展的關鍵。糖蜜是制糖業的主要副產品之一，其含有豐富的碳水化合物和氮磷物質可被微生物所利用，并且糖蜜年產量大(達到1.6×106kg)［6］，因此發展以糖蜜為原料的生物制氫產業具有廣闊的應用前景［7］。然而糖蜜的組成極其復雜，不僅含有對微生物生長有益的成分，同時存在多種微生物難以利用和轉化的成分，并對微生物的生長代謝產生抑制作用［8］。目前在國內外報道的糖蜜生物制氫研究中，多數以混合菌種為接種物(如活性污泥等)進行糖蜜產氫研究［9］，而利用純菌糖蜜發酵制氫的研究鮮見報道。李永峰等［10］從以糖蜜為底物的生物制氫反應器中分離到產氫新菌Biohydrogenbacterium R3 sp.nov.，屬于目前報道的產氫菌種產氫能力比較高的菌株之一。本文以高效產氫菌R3為研究對象，以糖蜜廢水為底物，研究連續流R3菌株糖蜜廢水發酵產氫能力。

1 材料與方法

1.1 試驗裝置

試驗采用連續流攪拌槽式反應器(CSTR)，為反應區與沉淀區一體化結構，模型反應器總容積18.8 L，有效容積9.6 L。反應器內部有三相分離器，使氣、液、固三相很好地分離，更有利于氣體的傳質與釋放。采用計量泵將原水從進水箱泵入反應器內，通過計量泵的流量以保證系統進水恒定。本試驗通過調節進水流量控制水力停留時間為6 h。整個反應器采用外纏電熱絲加熱方式，將溫度控制在(35±1)℃，實驗系統見圖1。

圖1 連續流生物制氫系統

1.2 菌種來源和厭氧培養方法

產氫新菌Biohydrogenbacterium R3 sp.nov.菌種鑒定的國際DNA數據庫登記號為AF363375，從生物制氫活性污泥中分離得到。其透射電鏡照片如圖2所示，R3為革蘭氏陽性菌，不形成芽孢，桿菌;大小為(0.3～0.5)μm×(1.5～2.0)μm;周生鞭毛，且鞭毛較長;形成的菌落呈現白色或乳白色，20～30 d可以長成至直徑為1.0～2.5 mm，菌落邊緣整齊，圓形，光滑，不透明;類脂粒4～6個，異染粒2～3個;該菌為嚴格厭氧菌。細菌培養基的制備和全部實驗操作采用改進的Hungate厭氧技術，以高純氮氣為氣相，35℃常規培養。

圖2 菌株R3的透射電鏡照片(20 000×)

1.3 試驗廢水

試驗廢水采用的是廢糖蜜加水稀釋而成，糖蜜廢水組成成分見表1，配置時投加一定量的有機氮磷，使得底物中的m(COD)∶m(N)∶m(P)保持在(200～500)∶5∶1左右，以保證R3菌株在生長過程中對氮、磷的需求。

表1 糖蜜廢水成分

1.4 培養基

基本培養基:葡萄糖20 g·L－1;胰蛋白胨4 g·L－1;牛肉膏2 g·L－1;酵母汁1 g·L－1;NaCl為4 g·L－1;K2HPO4為1.5 g·L－1;L－半胱氨酸0.5 g·L－1;發酵液10 mL;維生素液(鈷銨素0.01 g·L－1;抗壞血酸0.025 g·L－1;核黃素0.025 g·L－1;檸檬酸0.02 g·L－1;吡多醛0.05 g·L－1;葉酸0.01 g·L－1;對氨基苯甲酸0.01 g·L－1;肌酸0.025 g·L－1)10 mL;微量元素液(MnSO4·7H2O為0.01 g·L－1;ZnSO4·7H2O為0.05 g·L－1;H3BO3為0.01 g·L－1;N(CH2COOH)3為4.5 g·L－1;CaCl2·2H2O為0.01 g·L－1;Na2MoO4為0.01 g·L－1;CoCl2·6H2O為0.2 g·L－1;AlK(SO4)2為0.01 g·L－1)10 mL;刃天青(0.2%)，1～2 mL;pH為6.0～6.4。

1.5 分析方法

發酵氣體產物及組分采用SC－II型氣相色譜測定。熱導檢測器(TCD)，不銹鋼色譜填充柱長2.0 m;擔體Porapak Q，50～80目。采用氮氣為載氣，流速為30 mL/min。

液相末端發酵產物組分及質量分數采用GC－122型氣相色譜測定。氫火焰檢測器，不銹鋼色譜填充柱長2.0 m;擔體為GDX－103型，60～80目。柱溫、氣化室和檢測室溫度分別為190、220、220℃。氮氣作為載氣，流速為30 mL/min。

采用國家標準方法測定COD［11］，采用PHS－25型酸度計測量pH和氧化還原電位(ORP)，采用LML－1型濕式氣體流量計計量產氣量。

2 結果與分析

2.1 底物濃度對產氫能力的影響

產氣(氫)速率是衡量生物制氫反應器啟動效能的一個重要指標。圖2為底物質量濃度與系統產氣和產氫量的變化。從試驗結果中可以發現，當進水COD質量濃度在2 600～4 440 mg/L范圍內變化時，進水COD質量濃度的變化對純培養R3產氫系統的產氣量和產氫量有明顯的影響，產氣量和產氫量隨著進水COD質量濃度的下降而降低;然而，當進水COD質量濃度提高時，產氣量和產氫量也有相應的增加。CSTR發酵產氫系統的最大產氣量和產氫量分別為6.08 L和3 L。

2.2 pH值與COD去除率的變化

在廢水進入反應系統后，廢水中的物質所發生的一系列生理生化反應以及液體的稀釋作用，將迅速改變系統內的pH值。如含有大量溶解性碳水化合物(糖、淀粉等)的廢水進入反應器后，碳水化合物發酵產生的有機酸(特別是乙酸)的積累，將使系統內pH值下降。pH的變化不僅直接影響參與新陳代謝過程的酶活性，而且不同種類的細菌在不同pH生境條件下，生長繁殖的速率不同，發酵代謝產物的種類和數量也存在差異。圖4為CSTR反應器進出水pH值與COD去除率的變化情況。在反應器運行過程中，進水pH值的波動范圍很大，在3.46～6.45之間，而進水pH值與COD去除率呈現相同的變化趨勢，COD去除率在4.69%～35.86%之間波動。可見高效產氫菌株R3對進水pH值的變化十分敏感，較低的pH值導致微生物的活性下降，正常的生理代謝受到抑制。

圖3 底物質量濃度對產氫能力的影響

2.3 氧化還原電位的變化

氧化還原電位(ORP)對微生物生長生理、生化代謝均有明顯影響。生物體細胞內的各種生物化學反應，都是在特定的氧化還原電位范圍內發生的，超出特定的范圍，則反應不能發生，或者改變反應途徑。生境中的氧化還原電位可受多種因素影響。它與氧分壓有關，氧分壓高，氧化還原電位高;氧分壓低，氧化還原電位低。微生物對有機物的氧化及代謝過程中所產生的氫、硫化氫等還原性物質，也會使環境中的ORP降低。

圖4 進出水pH值與COD去除率的變化情況

在產氫發酵過程中，較低的氧化還原電位是產氫發酵微生物生長發育的必要條件。這是因為厭氧微生物的生存要求較低的氧化還原電位環境的原因，使它們的一些脫氫酶系包括輔酶I、鐵氧還蛋白和黃素蛋白等，要求低的氧化還原電位環境才能保持活性。CSTR反應器運行過程中ORP的變化情況如圖5所示。ORP基本上保持在較低水平(－445～－420 mV)，有利于連續流純菌株R3系統高效穩定產氫。觀察發現，ORP與COD去除率存在著一定的線性關系(見圖6)，y=0.729 5x+339.66(r2=0.657 7)。

圖5 CSTR反應器運行過程中ORP的變化情況

3 結論

在系統溫度36℃、水力停留時間6 h、系統pH值和ORP分別在4.0～4.38和－445～－420 mV等條件下，可以實現高效產氫菌株R3在CSTR反應器中連續厭氧制氫。

圖6 ORP與COD去除率之間的線性關系

進水底物質量濃度的變化對系統的產氫效能的影響十分明顯，進水COD在2 600～4 440 mg/L范圍內變化，分別得到最大產氣量和產氫量為6.08 L和3 L。進水pH值的降低影響系統的COD去除效率，但對出水pH值卻無明顯影響?？梢娺B續流純培養R3菌株是一個相對穩定的發酵制氫系統，ORP穩定在－445～－420 mV。ORP與COD去除率存在著一定的線性關系，y=0.729 5x+339.66(r2=0.657 7)。

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