草地硝化微生物與硝化作用研究進展

劉天增，南志標

(蘭州大學草地農業科技學院 農業部草地農業生態系統學重點實驗室，甘肅 蘭州 730020)

草地是地球上最為寶貴的自然資源和陸地生態系統的重要組分，不僅承擔著防風固沙、保持水土、涵養水源、調節氣候、維護生物多樣性等重要生態功能，而且也是重要的畜牧業生產基地，其功能的正常發揮對維持全球及區域性生態系統平衡有極其重要的作用。氮素作為植物必需的大量元素是限制草地生產力的主要因素之一，植物能直接吸收利用的土壤氮素主要是銨態氮和硝態氮，經常會因缺氮而使生長受到限制，進而降低草地生產力[1-2]。草地生態系統中，植物從土壤中吸收無機氮合成有機氮，部分被動物攝入轉變成動物產品，剩余部分通過糞便與尿液歸還土壤。沒被動物采食的植物變成凋落物，這些凋落物中的有機氮通過微生物礦化和硝化作用轉變為無機氮，參與氮循環過程。硝化作用是氮循環中的一個重要環節，對生態系統的氮平衡起決定性作用[3]。在溫度、pH值等環境條件適宜情況下，土壤中的硝化作用會迅速發生，而硝化作用產生的硝酸鹽淋失和N2O排放都會導致草地系統氮損失[4-5]。隨著人類對草地資源利用程度的不斷增加，土壤中的硝化作用會向大氣中釋放更多N2O，從而導致全球氣候不斷變暖[6]。近年來，過度放牧、草地農墾等已嚴重破壞草地氮循環過程[7]。因此，研究草地硝化微生物與硝化作用對提高草地生產力，促進草地合理開發與利用，改善草地生態環境等有十分重要的意義。本研究對近年來國內外草地硝化微生物及硝化作用研究成果進行回顧和總結。為今后合理開發和持續利用草地資源提供參考依據。

1 硝化作用

1.1硝化作用 硝化作用(nitrification)是指由硝化微生物將NH3氧化成NO2-，再氧化成NO3-的過程，是氮素生物地球化學循環中重要的一個環節。自然環境如水體和土壤中，硝化作用是一個主要由微生物介導的反應。陸地生態系統中，硝化作用一方面影響氮素對植物的供給；另一方面，由于硝態氮帶有負電荷，不易被土壤膠體吸附，易因淋溶而損失污染地下水，從而造成氮素損失[3]。

1.2硝化作用類型

1.2.1自養硝化作用 自養硝化作用分兩步進行，先由氨轉化為亞硝酸，然后由亞硝酸轉化為硝酸，這兩個過程分別由氨氧化細菌(ammonia oxidizing bacteria，AOB)和亞硝酸氧化細菌(nitrite oxidizing bacteria，NOB)完成。已知所有土壤中的AOB都屬變形菌綱(Proteobacteria) β亞綱，β-Proteobacteria亞綱的AOB可分兩個類群：即亞硝化單胞菌群(Nitrosomonas)和亞硝化螺菌群(Nitrosospira)兩個屬[8]。γ-Proteobacteria亞綱主要是亞硝化球菌屬(Nitrosococci)，適合在海洋環境中生長[9]。NOB主要包括硝化桿菌屬(Nitrobacter)、硝化球菌屬(Nitrococcus)、硝化刺菌屬(Nitrospina)和硝化螺菌屬(Nitrospira)[10-11]。迄今為止，土壤中只檢測到硝化桿菌屬，其他NOB屬在自然界的分布還不清楚。但由于氨氧化過程是硝化作用的限速步驟，氨單加氧酶(ammonia-monooxygenase,AMO)是氨氧化過程中的主要酶類，它催化氨轉變為羥胺，羥胺又由羥胺氧化酶(hydroxylamine oxidoreductase, HAO)催化生成亞硝酸[12]。因此，近年來AOB的研究報道遠多于NOB。

1.2.2異養硝化作用 異養硝化作用是指異養微生物在好氧條件下將還原態N(包括有機氮) 氧化為NO2-和NO3-的過程，在自然界的硝化過程中起著重要作用。異養硝化菌種類繁多，除自養硝化細菌外，真菌被認為是數量最大、效率最高的異養硝化菌。此外，某些細菌和放線菌也被確定為具硝化能力的異養微生物[13]。

通常，異養硝化微生物通過兩種代謝途徑進行硝化作用。1)某些已知異養硝化細菌如脫氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)、球硫小菌屬(Thiosphaerapantotropha)、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)和糞產堿桿菌(Alcaligenesfaecalis)等，與自養硝化菌有相似的氧化酶系統，先由氨單加氧酶催化氨氧化得到羥胺，然后由羥胺氧化酶催化得到亞硝酸氮[14]。所以，當代謝基質過剩時，這些異養微生物就有了生長優勢，保持較高的生長速率而抑制其他微生物的生長[15]。2)真菌硝化作用。Wood[16]發現，當過氧化氫和超氧化物同時存在時會生成羥基，而含氮化合物會與羥基發生反應；當氧化酶和過氧化物酶釋放到環境中時，細胞溶解和木質素降解過程中會給羥基的形成提供條件。異養硝化作用經常用來說明自養硝化微生物不能生長或未能檢測到土壤中實際發生的硝化作用，但對于異養硝化的機理及生理學意義還不清楚。

自養和異養硝化作用常用的區別方法是采用選擇性抑制劑。自Hynes和Knowles[17]提出乙炔可用于硝化抑制劑后，乙炔已成為最常用的自養硝化特效抑制劑，能被氨單加氧酶氧化成具有較高活性的物質，從而引起該酶不可逆的抑制作用。

2 硝化作用微生物

氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea, AOA)是一個獨立于AOB進化枝之外的進化類群，是自然界中最豐富的氨氧化微生物，其功能與AOB類似，可將NH4+氧化成NO2-。在AOA發現之前，通常認為AOB是硝化作用的主要執行者，隨著硝化作用的深入研究，AOA在氮循環過程中的重要作用被逐漸發現和認識。研究表明，氨氧化作用并非只由AOB類群完成。第1株AOA-Nitrasopumilus maritimus的成功培養有力證明了AOA在自然界中的存在[18]。AOA的發現迅速成為環境微生物生態學功能類群方面的研究熱點之一。國際上主要針對AOA的生態分布、豐度以及生態功能等開展系列研究。16S rRNA和DGGE分析表明，在酸性和中性土壤中AOA的種群結構完全不同，基因拷貝數及mRNA轉錄的多樣性與一系列pH梯度形成對照，AOA的amoA基因和轉錄多樣性隨著土壤pH值的升高而降低[19]。目前，很少有文獻報道草地AOA的多樣性以及AOA在氮循環中的作用。

AOB將氨轉化為硝酸鹽作為唯一的能源而進行氨氧作用，所有的AOB都含有編碼催化氨氧化第1步反應的氨單加氧酶基因amoA, amoA基因在氨氧化菌中普遍存在且可作為氨氧化菌特異的分子標記。AOB是嚴格的好氧型微生物，并廣泛分布于幾乎所有土壤中，其活性受土壤含水量的影響，過高或過低的土壤含水量都不利于硝化微生物活動。張樹蘭[20]研究表明，在土壤田間持水量達到60%時土壤硝化作用最為強烈，在土壤田間持水量達到40%和80%時土壤硝化作用都受到不同程度的抑制。AOB種群結構也受到土壤水分的調節，在半干旱地區不同的土壤水勢條件下，AOB種群結構差異顯著，而且在-100 kPa的水勢下土壤硝化勢最高[21]。同樣在稀樹草原上，AOB數量和硝化作用均是雨季最高，干旱季最低[22]。16S rRNA分析表明，在天然草地中AOB種群中的亞硝化螺菌3a和3b決定了硝化作用的滯后性。在亞硝化螺菌3a占優的天然草地土壤中出現了硝化作用的滯后現象，而在以亞硝化螺菌3b和亞硝化單胞菌為主的土壤中沒有觀察到硝化作用的滯后現象[23]。

AOA和AOB在土壤中共同存在，但它們的分布又取決于環境條件。在土壤中AOA占據多數，但在某些條件下又以AOB為主，硝化作用的差異主要與種群大小有關。有結果表明，在硝化作用過程中AOA的作用大于AOB，與AOA相比，AOB的種群變化較小[24]。Leininger等[25]研究認為，大多數土壤中AOA數量和活性上都要高于AOB，而且比AOB更能適應多種環境。土壤pH值對AOA有選擇性，在酸性土壤的硝化作用過程中，AOA和AOB具有完全不同的生理特性和生態作用[19]。有研究認為，草地土壤中AOA的數量與AOB相似[26-27]。Roux等[27]用古菌amoA的特異引物對法國Theix地區半天然放牧草地土壤進行了研究，試驗結果表明，放牧地的AOA豐富度顯著高于不放牧，并且與AOB的豐富度近似，休牧降低了AOA的豐富度，硝化活性與AOB和AOA的豐富度呈正相關。也有研究認為硝化作用與AOB豐富度相關[28]，而且認為在NH4+轉化為NO3-的過程中，AOB比AOA起更主要的作用[29]。所以，目前認為AOB在草地硝化作用中起主要作用，AOA還需要進一步研究。

3 影響草地硝化作用的因素

3.1家畜排泄物 氮是草原生態系統循環中的重要化學元素，放牧家畜通過土壤植物動物系統對草原土壤氮養分施加著顯著的影響。研究表明，放牧家畜對采食植物中的氮只消化吸收一部分，其中60%～90%的養分又以糞尿形式歸還草地[30]；當糞尿沉積草地后，糞尿中的氮通過微生物作用被轉化為可利用氮素形式。因此，家畜排泄物的返還通過加速草地氮循環，對參與氮素循環的微生物類群產生影響[31-32]。可見，糞尿沉積是放牧草地生態系統中硝化細菌種群結構發生變化的主要原因[33-34]。

畜尿沉積影響AOB的空間分布和種群結構及硝化酶活性[35]。當畜尿進入草地后尿素很快轉化為銨，使得土壤中NH4+濃度和pH值升高[36]，從而導致AOB菌種群結構改變。Mahmood和Prosser[37]在天然草地上施加不同濃度人工合成羊尿后發現，低濃度羊尿處理下AOB以亞硝化螺菌 cluster 4為主，中濃度和高濃度羊尿處理下以亞硝化螺菌 cluster 3為主，而亞硝化螺菌 cluster 2在低、中、高濃度羊尿處理中都存在；Patra等[38]和Webster等[23]也發現，由于天然、半天然和放牧草地重度放牧區表層土層NH4+-N含量顯著高于輕度放牧區，而不同濃度的NH4+導致不同放牧強度的AOB種群結構和硝化活性差異，且硝化活性變化前AOB種群結構已發生改變。同時，Roux等[39]通過對法國Theix地區已放牧35年的半天然草地進行研究，發現重牧下硝化酶活性比輕牧高；放牧導致AOB種群結構發生變化，使其硝化活性與豐富度增加，休牧降低其活性與豐富度。可見，不同NH4+濃度的選擇作用是AOB種群結構變化的主要原因，較高的NH4+-N能提高土壤硝化活性，從而給硝化細菌的生長提供了更有利的條件[40-41]。

3.2植物 植物是土壤微生物賴以生存的有機營養物質和重要能量來源，是影響土壤微生物群落的重要因素之一，其類型、群落組成等是土壤微生物區系變化的主要驅動力量[42]。Malchair等[43]研究種植豆科、禾本科和雜草植物對土壤AOB功能和多樣性的影響，PCR-DGGE結果表明豆科植物在種植16個月后，土壤AOB條帶數減少但硝化勢卻增加，AOB數目與硝化勢呈負相關關系。豆科植物土壤中AOB種群結構也與其他處理不同，主要差異在于亞硝化螺菌cluster 3。在種植禾草和雜草的土壤中沒有檢測到cluster 3b，在種植豆科植物的土壤中沒有檢測到cluster 3a。Webster等[23]研究發現亞硝化螺菌cluster 3又可分為兩個類群cluster 3a和cluster 3b。cluster 3a對于高濃度氨較為敏感，而cluster 3b和亞硝化單胞菌對高濃度氨不敏感。Habekost等[44]發現，與不種植豆科植物的土壤相比，種植豆科植物的土壤中微生物種群組成不同，含有更多的革蘭氏陰性細菌。

地上植物多樣性可引起地下根系分泌物和凋落物質量的多樣性，進而影響土壤微生物的活性[45]。不同放牧強度下半天然放牧草地3種主要植物絨毛草(Holcuslanatus)、燕麥草(Arrhenatherumelatius)和鴨茅(Dactylisglomerata)之間土壤NH4+-N含量無顯著差異。放牧和植物類型共同影響AOB的種群結構，在燕麥和鴨茅土壤中放牧對AOB有顯著影響，但在絨毛草土壤中無顯著影響。不同植物類型對AOB有顯著影響，然而與放牧相比，植物的影響要弱于放牧[39]。Rutigliano等[46]研究了地中海地區高灌木、矮灌木和草地植被類型下土壤的硝化作用后發現，草地的硝化作用高于高灌木和矮灌木，而且水分是限制硝化作用的重要因素。在內蒙古半干旱地區冬季植物停止生長的時期，草地的硝化作用高于灌木和森林，在冬季硝化作用是氮素轉化的主要形式，形成的礦質氮在第2年春天又可以被植物吸收，但如果降水過多，會導致更多的氮素損失[47]。Smits等[48]研究了斜坡植被梯度對草地硝化作用的影響，結果發現，與坡頂和坡底相比，中間植被區域的NH4+/NO3-最高，且硝化作用受到明顯抑制。然而，硝化速率的差異與AOB的種群結構無關。

銨的有效性是解釋上述結果的主要原因，豆科植物可以通過生物固氮來增加土壤中的氮。增加銨有效性來影響硝化作用主要有兩個途徑：一是增加硝化微生物的種群數量和改變種群結構。一般認為銨是硝化作用的限制因素，所以增加AOB的種群數量會增強硝化作用。二是高濃度銨會影響AOB的種群組成，使AOB盡可能的適應周圍的土壤環境。盡管所有AOB的代謝都基本相似，但不同的種對NH3的親合力不同[49]，例如，亞硝化螺菌屬中的一些種類對氨濃度為6～11 μmol/L內都有親合力[50]。這一機理淘汰了硝化效率低的菌種，從而解釋了AOB豐富度降低而硝化作用卻增加的現象。

3.3火燒 在干旱或半干旱環境下，火燒作為一種重要的自然干擾方式會引起草地生態系統短期或長期的變化[51-52]。火燒對草地硝化作用的影響不同學者有不同的觀點。在高草草原，適宜的火燒對植物的生長是有利的，火燒有助于提高土壤微生物的活性[53]。李玉中等[54]采用同位素15N庫稀釋技術結合擾動較小的管型取樣法，測定了羊草(Leymuschinensis)草地火燒與未火燒區不同季節土壤氮的硝化速率，結果表明，火燒地的硝化速率在草地返青后的4、5月高于未燒地，到生長季末的9月又高于未燒地。草地火燒后地表變黑，去除了地上植物和凋落物的遮蔭作用，這樣就減少了火燒地對太陽能的反射，使火燒地能夠吸收較多的太陽能,增加土壤溫度，而溫度的升高又利于土壤中氮素轉化細菌的活動[55]。火燒后可使草地土壤pH值升高，在一定范圍內有助于硝化細菌的生長。草地火燒后大量的營養元素以無機態的形式從地上凋落物中釋放出來，在某種程度上相當于施肥的作用，從而促進了硝化作用。然而，Zhou等[56]研究表明，火燒顯著降低了內蒙古典型草原土壤的硝化作用；筆者認為火燒并未影響土壤中無機氮的含量，但與未燒地相比火燒地減少了地上凋落物和土壤含水量，抑制了硝化作用。

3.4土壤pH值 在20世紀初，由于檢測到酸性土壤中NO3-濃度很低，只有加入石灰或采用其他提高pH值方法的土壤中才會有的NO3-積累，所以，一般認為在酸性土壤中(pH值<5)不存在NH4+轉化為NO3-的硝化作用過程。然而隨著有關酸性土壤中有硝態氮積累的報道的增多，發現酸性土壤中存在微生物的硝化活性[57-58]。到20世紀后期，普遍認為在很多的酸性土壤中都能發生硝化作用。酸性土壤中硝化作用的許多報道及其對環境的負面影響，推動了對這些微生物及相關機理的研究。大部分的研究集中在化能無機營養型(自養硝化作用)和化能有機營養型(異養硝化作用)的相關報道。

至今，有關酸性土壤硝化作用產生的機理得到了較深入的研究，主要有兩種解釋：1)硝化細菌為酸敏感菌株，其硝化作用僅產生于pH值呈中性的微小區域中，可能是由于施肥或其他措施使局部區域pH值上升導致硝化作用[59-60]。2)硝化細菌在細胞周圍形成一粘液層，從而能適應酸性環境[61]。Islam等[62]利用15N標記技術在室內測定了澳大利亞兩種有機質含量較高的酸性草地土壤中的異養硝化作用，發現異養硝化作用分別占到總硝化作用的7%和19%。異養硝化細菌利用有機氮化合物而不是NH4+作為硝化作用的底物。

4 硝化作用與N2O排放

N2O是重要溫室氣體，是氨氧化過程中的一種副產物，硝化和反硝化作用是土壤中N2O生成的兩個最主要過程。草地系統中，放牧家畜糞尿沉積增加N2O的排放量。Williams等[63]用15N標記人工羊尿施加草地后發現，畜尿沉積后24 h內，N2O的排放量約占整個草地的8%；24 h后，N2O排放從3.9增加到42.3 μg/(m2·h)，且硝化和反硝化作用對N2O的貢獻相等。

土壤環境的不均衡性，使硝化和反硝化作用同時發生。這主要與土壤持水量有很大關系，45%的土壤持水量既提供了有氧環境又提供了厭氧環境，使硝化作用和反硝化作用同時發生[64]。利用AIM乙炔抑制法測試了內蒙古放牧和非放牧羊草草原土壤N2O產生的微生物過程，結果表明，在春季植物返青時，羊草草原非放牧土壤自養硝化作用較強，反硝化作用僅產生少量的N2O；放牧土壤N2O的產生過程中以異養硝化作用為主，反硝化作用也產生少量的N2O。在夏季和秋季的土壤N2O的產生過程中仍以異養硝化作用為主，放牧草原反硝化作用對N2O的產生卻沒起作用。冬季放牧草原仍是硝化作用過程產生N2O，其中自養和異養硝化菌的貢獻基本相同，反硝化作用卻無貢獻。由于牲畜糞尿的排泄，放牧草原較非放牧草原土壤有較多的外加有機碳、氮源，有助于土壤微生物的活性，促進了土壤硝化作用和N2O的產生速率[5]。過度放牧地硝化速率始終高于保護區，主要原因是放牧地由于放牧不當致使其嚴重退化，牧草生長矮小，對土壤中礦化的銨態氮和硝態氮吸收減少，從而使得NH4+有一定的積累，因而土壤硝化作用強度較高，產生的硝態氮由于植物利用較少，使得硝態氮有一定的積累[65]。Zaman等[66]在新西蘭放牧草地添加尿酶抑制劑(Agrotain)和硝化作用抑制劑(DCD)后發現，Agrotain減少NH3排放，對N2O無影響；DCD減少了N2O排放但卻增加了NH3排放；兩者混合使用后同時減少了NH3和N2O的排放，而且增加了牧草產量及植物對氮素的吸收。

5 研究展望

在草原土壤中，硝化微生物與土壤中氮素的轉化及其利用有直接關系，與生態因子的改變密切相關。研究草地硝化微生物有助于草地生態系統中氮素的損失和管理，為草原管理提供深層次的理論依據。從目前的研究現狀來看，雖然還無法通過傳統微生物學的方法對其進行研究，但是分子生態學方法的引入給該領域的研究帶來了新的契機。根據現有的硝化微生物生態學知識對傳統的微生物學方法進行改進，結合現代分子生態學方法篩選出對環境適應能力強的特殊硝化微生物，特別是對高濃度氨不敏感的微生物種群將是該領域研究的重點。此外，隨著研究的深入，與硝化作用有關的一系列科學問題有待研究者進一步探討。例如：硝化微生物種群結構和硝化活性的變化能否解釋實際土壤硝化作用的變化？在放牧草地中，當放牧強度改變后土壤中硝化微生物的數量或種群結構的變化是由植物群落引起的還是由家畜排泄物及踐踏作用引起的？硝化細菌和古菌在土壤N2O排放過程中誰的貢獻較大？這些問題都缺乏系統地研究，至今還沒有一致的結論。目前對硝化微生物的研究已經涉及到諸多方面，然而在探索此類微生物功能代謝與生態分布的同時，如何利用這一類特殊的微生物資源為生態環境服務、對環境變化進行預警仍然有待于科研工作者不懈的努力。

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