紫花苜蓿耐鹽、抗旱生理機(jī)制研究進(jìn)展

包愛(ài)科,杜寶強(qiáng),王鎖民

(蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020)

紫花苜蓿(Medicagosativa)素有“牧草之王”的美稱，是世界上利用最早、栽培最廣的一種優(yōu)良豆科牧草[1]。在我國(guó)西北地區(qū)，紫花苜蓿種植面積占該地區(qū)全部栽培草地面積的80%左右，對(duì)當(dāng)?shù)剞r(nóng)牧業(yè)發(fā)展和生態(tài)環(huán)境建設(shè)作出了重要貢獻(xiàn)[2]。然而，我國(guó)西北地區(qū)日益加劇的干旱和土地鹽漬化已使紫花苜蓿的種植面積減少，并對(duì)其產(chǎn)量構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。對(duì)紫花苜蓿適應(yīng)鹽和干旱的生理機(jī)制展開(kāi)系統(tǒng)研究，將為培育優(yōu)良的耐鹽抗旱品種、提高西北干旱半干旱地區(qū)紫花苜蓿栽培草地產(chǎn)量具有重要意義。本研究主要對(duì)近年來(lái)紫花苜蓿抗鹽和干旱的生理機(jī)制及其抗性評(píng)價(jià)等方面的主要研究成果進(jìn)行概述。

1 紫花苜蓿的耐鹽生理研究

1.1有機(jī)滲透調(diào)節(jié)與苜蓿的耐鹽性 在鹽脅迫下許多植物表現(xiàn)出游離脯氨酸大量積累的現(xiàn)象[3]，但對(duì)于鹽脅迫下植物積累脯氨酸的生理意義仍存在分歧。目前普遍認(rèn)為脯氨酸的積累可以增加植物對(duì)滲透脅迫的耐受性[4]。研究表明，在相同脅迫條件下，耐鹽苜蓿細(xì)胞系脯氨酸含量比敏鹽苜蓿高；并從耐鹽苜蓿中篩選到一個(gè)與細(xì)胞壁中脯氨酸密切相關(guān)的基因PA9，該基因僅在苜蓿根中表達(dá)，在葉中并未發(fā)現(xiàn)；在鹽脅迫或外源脫落酸(ABA)處理下，PA9基因在耐鹽植株與敏鹽植株中的轉(zhuǎn)錄水平都有所增加，但在耐鹽苜蓿中增加的更多[5]。PCR擴(kuò)增表明，耐鹽和敏鹽苜蓿細(xì)胞系中都存在該基因片段，但Southern雜交表明它在耐鹽系列中存在多個(gè)拷貝，而在敏鹽系列中卻只有一個(gè)[6]。楊躍霞等[7]的研究也發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下紫花苜蓿各組織中積累大量脯氨酸，其含量為葉>莖>根，且外源ABA 能顯著提高各組織中脯氨酸的含量，并增強(qiáng)植株的耐鹽性。此外，桂枝等[8-9]的研究表明，在不同鹽濃度下，紫花苜蓿耐鹽品種體內(nèi)的脯氨酸含量顯著高于敏鹽品種；隨著鹽濃度的增大，不同品種中游離脯氨酸含量均出現(xiàn)2個(gè)峰值，但敏鹽品種中游離脯氨酸含量的2個(gè)峰值均顯著低于耐鹽品種。因此，鹽脅迫可以誘導(dǎo)其體內(nèi)脯氨酸含量增加，而且脯氨酸可以作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)提高紫花苜蓿對(duì)鹽脅迫的耐受性，特別是ABA可能對(duì)該過(guò)程具有調(diào)控作用，但其具體的信號(hào)途徑還有待于進(jìn)一步研究。

除積累游離脯氨酸外，有研究發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫下，紫花苜蓿體內(nèi)的可溶性糖[10]和甜菜堿含量[11]顯著升高，且與品種的耐鹽性呈正相關(guān)關(guān)系。但其相關(guān)機(jī)制還不清楚。

1.2拒Na+能力與苜蓿的耐鹽性 研究表明，和大多數(shù)甜土植物一樣，紫花苜蓿屬于拒Na+植物，而且其拒Na+能力與耐鹽性密切相關(guān)[12]。鹽脅迫下，雖然各紫花苜蓿品種地上部Na+含量都有所上升，但與耐鹽品種相比，敏鹽品種地上部Na+含量更高[13]。地上部較高的Na+/K+是造成紫花苜蓿鹽害的主要原因[14]，Bao等[2]研究表明，地上部Na+/K+與品種的耐鹽性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。因此，在鹽脅迫下維持較低的Na+/K+有助于減輕鹽分對(duì)紫花苜蓿植株，特別是其地上部的傷害，從而維持其正常生長(zhǎng)。

1.3抗氧化能力與苜蓿的耐鹽性 在逆境脅迫條件下，低濃度的活性氧(reactive oxygen species，ROS)是植物體內(nèi)的一類適應(yīng)信號(hào)分子，但當(dāng)ROS積累到高濃度時(shí)就能造成植物的過(guò)氧化傷害，甚至細(xì)胞的死亡[15]。這可能是因?yàn)镽OS一方面能與DNA發(fā)生反應(yīng)，引起核苷酸的修飾從而使DNA發(fā)生降解；另一方面，它們還能通過(guò)改變蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸的特性，造成細(xì)胞膜的膜脂過(guò)氧化，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)[14]。植物體內(nèi)的超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)以及過(guò)氧化物酶(POD)等酶促系統(tǒng)對(duì)清除ROS至關(guān)重要，有研究[16]表明，在不同濃度鹽的脅迫下，紫花苜蓿葉片的SOD酶的活性隨著鹽濃度的升高而增強(qiáng)，但當(dāng)鹽濃度超過(guò)一定值(100 mmol/L)時(shí)，SOD活性減弱。這說(shuō)明SOD參與了紫花苜蓿對(duì)一定程度鹽脅迫的響應(yīng)，但鹽脅迫強(qiáng)度過(guò)大，會(huì)使酶活性下降，從而對(duì)植物造成傷害。

1.4苜蓿的耐鹽性與光合作用 非生物脅迫(比如鹽或干旱)往往造成植物生物量的下降，而生物量的改變主要取決于光合作用的變化，因此非生物脅迫下植物能否保持較高的光合效率往往與其抗逆性密切相關(guān)[17]。Winicov和Bastola[18]發(fā)現(xiàn)，相比敏鹽細(xì)胞系，鹽脅迫下耐鹽紫花苜蓿系列中葉綠體DNA的拷貝數(shù)增加了50%，葉綠素含量也顯著增加，葉綠體中參與光合作用的基因(psbA,psbD,psaB,atpB,rbcL)以及細(xì)胞核中參與光合作用的基因(Pcab4,Pcab,rbcS)的轉(zhuǎn)錄水平都不同程度地上升；通過(guò)核連綴轉(zhuǎn)錄分析(run-on transcription assays)發(fā)現(xiàn)一些光合作用相關(guān)基因(如1，5-二磷酸核酮糖羧化氧化酶的大小亞基基因rbcL和rbcS)的mRNA水平增加既與這些基因轉(zhuǎn)錄水平的上升有關(guān)，同時(shí)也與鹽脅迫下mRNA的穩(wěn)定性加強(qiáng)有關(guān)。此外，鹽脅迫下，耐鹽品種具有更高的葉綠素含量[11,19]。可見(jiàn)光合作用的加強(qiáng)與紫花苜蓿耐鹽性強(qiáng)弱有著密切的關(guān)系。

2 紫花苜蓿的抗旱生理研究

2.1滲透調(diào)節(jié)與苜蓿的抗旱性 游離脯氨酸可作為植物的滲透調(diào)節(jié)劑，參與紫花苜蓿滲透調(diào)節(jié)。

李波等[20]在人工模擬干旱脅迫條件(PEG脅迫)下，研究了干旱脅迫對(duì)4個(gè)紫花苜蓿品種游離脯氨酸積累量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個(gè)品種在不同滲透脅迫下、一定時(shí)間范圍內(nèi)都有游離脯氨酸的積累，而且均在20% PEG溶液中48 h內(nèi)的積累量最多 。田福平等[21]對(duì)9個(gè)紫花苜蓿品種在黃土高原丘陵溝壑大田干旱條件下的研究表明，干旱脅迫下紫花苜蓿體內(nèi)游離脯氨酸大量積累，并與含水量和生物量有相關(guān)性。以上結(jié)果說(shuō)明紫花苜蓿的抗旱性可能與干旱脅迫下其體內(nèi)游離脯氨酸的積累量密切相關(guān)。也有研究表明，干旱脅迫下抗旱性強(qiáng)的苜蓿體內(nèi)的脯氨酸積累量少于抗旱性弱的品種，并且抗旱性較強(qiáng)的苜蓿游離脯氨酸積累的敏感性差，但持續(xù)積累時(shí)間長(zhǎng)，說(shuō)明脯氨酸積累的整個(gè)過(guò)程可能就是紫花苜蓿不斷適應(yīng)干旱的過(guò)程[22]。此外，在輕度水分脅迫時(shí)，苜蓿根瘤組織中還可積累較多脯氨酸，從而保護(hù)苜蓿根瘤代謝酶和結(jié)構(gòu)蛋白免受水分脅迫的破壞，減輕干旱對(duì)植物組織的危害程度[23]。另外，趙金梅等[24]發(fā)現(xiàn)，水分脅迫下4個(gè)苜蓿品種的甜菜堿含量和甜菜堿醛脫氫酶活性均明顯增加，但各品種間差異顯著，甜菜堿積累量與品種的抗旱性呈正相關(guān)關(guān)系。除積累脯氨酸和甜菜堿等有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以外，干旱脅迫下紫花苜蓿還可以通過(guò)吸收K+來(lái)進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)。干旱條件下紫花苜蓿植株中Mg2+、Ca2+和Zn2+等二價(jià)離子含量減少，但K+含量卻顯著增加[25]。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)K+在紫花苜蓿適應(yīng)水分脅迫中有著重要作用，且在紫花苜蓿不同部位的積累量不同，其中花序要高于葉；有趣的是，在干旱脅迫下，紫花苜蓿不同部位的K+含量與脯氨酸含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明K+與脯氨酸在紫花苜蓿響應(yīng)干旱脅迫過(guò)程中存在某種互補(bǔ)關(guān)系[26]。

2.2抗氧化能力與苜蓿的抗旱性 干旱脅迫下，苜蓿葉片SOD和POD活性增高、抗氧化物類胡蘿卜素和抗壞血酸含量增加，抗旱品種抗氧化酶促系統(tǒng)與非酶促系統(tǒng)內(nèi)部協(xié)調(diào)性強(qiáng)[27]。用PEG對(duì)紫花苜蓿進(jìn)行滲透脅迫，發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿體內(nèi)SOD活性在PEG脅迫1 d后升高，3 d后開(kāi)始下降，并且下降幅度隨著脅迫的增強(qiáng)而加大；POD活性在輕度脅迫下隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，重度脅迫1 d后達(dá)到最大， 5 d后顯著下降；而在輕度和重度脅迫下CAT活性均隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈持續(xù)下降態(tài)勢(shì)[28]。這說(shuō)明外界脅迫對(duì)于植物細(xì)胞清除活性氧的能力可能有一個(gè)閾值，當(dāng)脅迫強(qiáng)度在閾值之內(nèi)，植株能夠通過(guò)提高保護(hù)酶活性，有效清除自由基傷害，當(dāng)脅迫強(qiáng)度超過(guò)這個(gè)閾值，保護(hù)酶活性就會(huì)下降。然而，在大田自然干旱條件下，隨著干旱程度的加深，苜蓿葉片POD酶活性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，而CAT酶活性呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[29]，這與PEG模擬滲透脅迫的結(jié)果不太吻合，說(shuō)明苜蓿的抗氧化系統(tǒng)可能對(duì)PEG滲透脅迫和自然干旱有不同的反應(yīng)。

周瑞蓮等[30]用PEG溶液對(duì)不同抗旱性苜蓿進(jìn)行脅迫發(fā)現(xiàn)，相比抗旱性弱的天水苜蓿，抗旱性強(qiáng)的定西苜蓿葉中SOD對(duì)干旱較為敏感，其活性在脅迫后迅速升高；所有品種葉中CAT活性隨PEG脅迫濃度增加而升高，但抗旱性較強(qiáng)的定西苜蓿增幅最大。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)不同苜蓿品種抗旱性的強(qiáng)弱主要取決于葉中POD同工酶活性、CAT同工酶譜，以及根中POD同工酶新增譜帶和CAT同工酶譜的穩(wěn)定性[31]。但也有研究認(rèn)為，苜蓿抗旱性特性只與POD活性相關(guān)，與同功酶譜帶數(shù)并無(wú)直接關(guān)系[32]。

2.3苜蓿的抗旱性與光合作用 與其他牧草相比，紫花苜蓿的光合作用和呼吸作用受干旱脅迫的影響相對(duì)較小，通常在土壤含水量為田間最大持水量的35%以下時(shí)，大多數(shù)紫花苜蓿的光合速率與呼吸速率才會(huì)出現(xiàn)顯著下降，而多年生黑麥草(Loliumperenne)和紅三葉(Trifoliumpratense)的光合作用在土壤含水量為土壤最大含水量的45%～55%時(shí)就會(huì)受到影響[33]。最新研究顯示[34]，不同紫花苜蓿品種在旱作條件下光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)和氣孔導(dǎo)度(Gs)的日變化均存在差異。干旱脅迫使紫花苜蓿Pn、Tr、Gs以及葉綠素含量(Chl)不同程度下降，葉綠體超微結(jié)構(gòu)遭到破壞；但隨著干旱脅迫程度的加重，抗旱性強(qiáng)的品種的Pn比抗旱性弱的品種下降較慢，葉綠體超微結(jié)構(gòu)受到的破壞也較小，從而使其能夠在干旱條件下生長(zhǎng)的更好[35]。

2.4內(nèi)源激素與苜蓿的抗旱性 在正常條件下，植物依靠其體內(nèi)各種激素間的相互協(xié)調(diào)來(lái)保證正常的代謝和生長(zhǎng)發(fā)育，當(dāng)植物遭受到一定限度的脅迫后，體內(nèi)各種內(nèi)源激素水平的平衡就會(huì)發(fā)生改變，從而調(diào)節(jié)其生理機(jī)能和生長(zhǎng)節(jié)律，以適應(yīng)不利環(huán)境[36]。目前，關(guān)于內(nèi)源激素與紫花苜蓿抗旱性的關(guān)系的研究大多集中在ABA上。張志勝和趙世緒[37]用PEG對(duì)抗旱苜蓿愈傷組織進(jìn)行滲透脅迫，發(fā)現(xiàn)愈傷組織中產(chǎn)生了大量ABA，且滲透脅迫強(qiáng)度越大，ABA積累量越多。Ivanova等[38]通過(guò)觀察不同基因型苜蓿在干旱脅迫下葉片中ABA水平變化規(guī)律指出，在受到干旱脅迫時(shí)，葉片ABA含量以及維持高水平ABA的時(shí)間因苜蓿基因型的不同而存在差異。韓瑞宏等[39]發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下ABA含量在不同紫花苜蓿品種中均呈上升趨勢(shì)，但在抗旱性強(qiáng)的品種中上升幅度大于抗旱性弱的品種。這些研究結(jié)果說(shuō)明,ABA在調(diào)控紫花苜蓿適應(yīng)干旱過(guò)程中起著重要作用。

3 紫花苜蓿耐鹽性和抗旱性評(píng)價(jià)

大量研究表明，不同紫花苜蓿品種的耐鹽、抗旱性差異很大，評(píng)價(jià)不同品種的抗逆性，一直是育種學(xué)家挖掘和培育抗性品種的常用手段[12]。

在植物耐鹽性評(píng)價(jià)中首先要考慮的問(wèn)題就是選擇合適的評(píng)價(jià)時(shí)期。早在1958年，Bernstein和Hayward[40]就提出耐鹽性評(píng)價(jià)應(yīng)該選在植物對(duì)鹽分最為敏感的階段進(jìn)行。在種子萌發(fā)期和幼苗期，紫花苜蓿對(duì)鹽脅迫較成株期更為敏感[41]，因而在早期進(jìn)行耐鹽性評(píng)價(jià)似乎更為合理。關(guān)于苜蓿種子萌發(fā)期耐鹽性評(píng)價(jià)已有大量報(bào)道[42-43]。然而有研究表明某些植物的種子萌發(fā)期和苗期耐鹽性并無(wú)直接的相關(guān)性，其中包括紫花苜蓿，這是由于植物幼苗建植期對(duì)非生物脅迫極為敏感，往往導(dǎo)致建植失敗，對(duì)后期產(chǎn)量形成造成很大影響[41]，因此有人認(rèn)為在幼苗期評(píng)價(jià)紫花苜蓿耐鹽性可能更加可靠。目前國(guó)內(nèi)外也有一些關(guān)于紫花苜蓿苗期評(píng)價(jià)的成功報(bào)道，取得了很好的效果[41,44-45]。在早期的苜蓿苗期耐鹽性評(píng)價(jià)中，最常用的評(píng)價(jià)指標(biāo)往往是農(nóng)藝學(xué)指標(biāo)，包括株高、生物量、根長(zhǎng)和分枝數(shù)等[41,45]。這些指標(biāo)其實(shí)是植物體內(nèi)生理生化過(guò)程響應(yīng)鹽分脅迫的集中體現(xiàn)，雖然使用時(shí)代表性好、容易測(cè)定，但在實(shí)際測(cè)定過(guò)程中易受其他環(huán)境因素的干擾，從而影響評(píng)價(jià)結(jié)果的準(zhǔn)確性[2,12]。因此近年來(lái)，一些生理指標(biāo)逐漸被應(yīng)用到紫花苜蓿的耐鹽性評(píng)價(jià)中，其中公認(rèn)的指標(biāo)包括脯氨酸含量[9,46]、抗氧化酶[8]、膜透性和MDA含量[16]以及K+/Na+等[14,47]。但是，由于植物的耐鹽性是一個(gè)十分復(fù)雜的機(jī)制，僅用某幾個(gè)生理指標(biāo)很難全面反映其耐鹽性。因此，選取細(xì)胞膜透性、地上部K+/Na+、MDA含量和地上部生物量對(duì)西北地區(qū)種植的5個(gè)紫花苜蓿品種通過(guò)隸屬函數(shù)法進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)，篩選出耐鹽品種，并建立了一套簡(jiǎn)便有效的評(píng)價(jià)體系[2]。

在紫花苜蓿抗旱性評(píng)價(jià)方面，現(xiàn)有的研究大都集中在苗期進(jìn)行，傳統(tǒng)的評(píng)價(jià)多采用大量的農(nóng)藝學(xué)指標(biāo)[48]，鑒于這些指標(biāo)存在諸多不足，近年來(lái)對(duì)于生理指標(biāo)也進(jìn)行了很多研究，已經(jīng)公認(rèn)可以用于苜蓿抗旱性評(píng)價(jià)的生理指標(biāo)主要有膜透性[27,49]、葉片相對(duì)含水量[50]、滲透勢(shì)和抗氧化酶[27]等。但植物的抗旱機(jī)制也非常復(fù)雜，僅通過(guò)某幾個(gè)生理指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)往往導(dǎo)致片面的結(jié)果，因此同樣需要多指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)。相對(duì)耐鹽性評(píng)價(jià)而言，有關(guān)紫花苜蓿抗旱性綜合評(píng)價(jià)的研究進(jìn)行的較早、也較多，涉及到很多評(píng)判方法：陶玲[51]使用21個(gè)抗旱指標(biāo)對(duì)14個(gè)紫花苜蓿品種進(jìn)行了系統(tǒng)聚類；宋淑明[52]在評(píng)價(jià)紫花苜蓿抗旱性時(shí)采用了隸屬函數(shù)法；韓瑞宏等[53]將17個(gè)差異顯著的抗旱指標(biāo)歸納成株型因子、根系因子、生物量因子和脅迫指數(shù)因子4個(gè)主成分，然后對(duì)10個(gè)紫花苜蓿種質(zhì)資源的抗旱性利用隸屬函數(shù)法進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)。當(dāng)然，各種方法僅僅是一種手段，其目的是對(duì)紫花苜蓿抗旱性做出客觀的評(píng)價(jià)，在實(shí)際評(píng)價(jià)過(guò)程中應(yīng)取長(zhǎng)補(bǔ)短。李源等[54]在日光溫室模擬干旱脅迫條件下，通過(guò)測(cè)定存活率、株高、地上生物量、地下生物量、根冠比、根系長(zhǎng)度等形態(tài)指標(biāo)，比較聚類分析法、抗旱性等級(jí)評(píng)價(jià)賦分法和標(biāo)準(zhǔn)差系數(shù)賦予權(quán)重法3種綜合評(píng)價(jià)方法的差異，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)差系數(shù)賦予權(quán)重法比前2種方法所得的抗旱性評(píng)價(jià)結(jié)果更具科學(xué)合理性。

綜上所述，在評(píng)價(jià)紫花苜蓿耐鹽、抗旱性時(shí)可以考慮遵循以下原則：評(píng)價(jià)時(shí)間最好選在苗期進(jìn)行，指標(biāo)應(yīng)選擇具有代表性的農(nóng)藝學(xué)指標(biāo)和一些與耐鹽抗旱性密切相關(guān)，且便于測(cè)定的生理指標(biāo)，通過(guò)適宜的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法得出綜合結(jié)論，這樣既能充分照顧到不同品種間抗逆機(jī)制的差異，也可有效避免單一指標(biāo)(特別是生理指標(biāo))導(dǎo)致評(píng)價(jià)結(jié)果的偏差。

4 結(jié)語(yǔ)

由于紫花苜蓿在世界各國(guó)畜牧業(yè)中有著非常重要的地位，有關(guān)其耐鹽和抗旱生理的研究一直以來(lái)都是牧草學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在該領(lǐng)域做了大量的研究工作，初步查清了紫花苜蓿響應(yīng)鹽和干旱脅迫時(shí)的生理機(jī)制；并在此基礎(chǔ)上利用與苜蓿耐鹽性或抗旱性密切相關(guān)的生理學(xué)或農(nóng)藝學(xué)指標(biāo)對(duì)不同品種的抗逆性進(jìn)行評(píng)價(jià)，篩選出一大批具有較強(qiáng)耐鹽性或抗旱性的優(yōu)良種植資源。然而，相對(duì)其他栽培作物而言，紫花苜蓿耐鹽和抗旱的深層機(jī)制及其調(diào)控途徑的研究還較為薄弱，未來(lái)還需進(jìn)一步探究，這將為通過(guò)生理育種手段培育高產(chǎn)、抗逆的新品種提供理論依據(jù)；此外，在系統(tǒng)明晰紫花苜蓿耐鹽抗旱機(jī)制的基礎(chǔ)上，深入挖掘參與其響應(yīng)干旱或高鹽環(huán)境過(guò)程的重要主效基因及其上游調(diào)控因子，對(duì)于通過(guò)生物技術(shù)手段提高紫花苜蓿的耐鹽性和抗旱性具有十分重要的意義。

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