配位對二氫楊梅素晶體結構與抗氧化活性的影響

俞思明，朱思明*，于淑娟，林景聰，許 敏

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州 510640)

配位對二氫楊梅素晶體結構與抗氧化活性的影響

俞思明，朱思明*，于淑娟，林景聰，許 敏

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州 510640)

食用植物有效成分的非晶化配位可能會產生新的或更好的藥物活性。本實驗研究二氫楊梅素(DMY)與Cu配位的優化工藝條件、配位前后DMY的晶體結構和抗氧化活性的變化。結果表明：DMY與Cu配合的最佳工藝條件為40℃、反應時間60min、pH 9.5；配位后DMY的UV-Vis光譜最大吸收峰由292nm紅移至332nm；經理論化學計算和FT-IR光譜證實，DMY的4位羰基和5位羥基O原子參與配位；配合物對羥自由基(·OH)的清除能力提高，這可能和配位后DMY出現的非晶化現象有關。

二氫楊梅素(DMY)；Cu；配合物；抗氧化

食用植物有效成分配位后可能產生新的或更好的藥物活性，中藥配合物新藥是中藥新藥研制的新方向[1]。據文獻報道，某些食用植物有效成分的非晶化往往會提高其生物活性[2]。二氫楊梅素(3,5,7,3＇,4＇,5＇-六羥基2,3-雙氫黃酮醇，dihydromyricetin，DMY)，又稱蛇葡萄素，雙氫楊梅素，是一類雙氫黃酮醇類化合物[3]。其結構式見圖l。在顯齒蛇葡萄屬植物中(如藤茶，主要分布于長江流域以南的廣東、廣西等地)其含量高達20%[4]。有關研究表明DMY具有清除氧自由基，防止油脂食品氧化變質及消炎、抑菌、降脂、抗腫瘤等生理活性[5-6]。有學者認為二氫楊梅素可以螯合金屬離子并且螯合作用發生在3-羥基-4-羰基上或3',4'酚羥基上，從而消除金屬離子對自由基氧化的催化作用[7-8]。國內外對DMY與鐵、鋅離子的螯合產物的研究已經很多。但是，有關DMY與Cu螯合產物的晶體結構、抗氧化性變化及兩者之間關系的研究報道還較少，缺乏系統性的研究。

本實驗探討人體必需微量元素Cu與DMY的配合的最佳工藝條件，以及配位前后DMY抗氧化活性的變化和晶體結構變化，以期改善配體DMY的生物活性或發現新的生物活性，尋找DMY配位后反應活性變化的非晶化根據。

圖1 二氫楊梅素的化學結構Fig.1 Chemical structure of dihydromyricetin (DMY)

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

二氫楊梅素 參考文獻[9]自制；無水乙醇 天津市凱通化學試劑有限公司；碳酸鈉、氯化銅 天津市科茂化學試劑有限公司。

S11-2恒溫水浴鍋 上海躍進醫療器械廠；LDA-2A真空干燥箱 上海一恒科技有限公司；TU-1810 型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；FT-IR-650傅里葉紅外光譜儀 天津港東科技發展股份有限公司；D8 ADVANCE XRD儀 德國Bruker公司。

1.2 方法

1.2.1 DMY-Cu配合物合成的單因素試驗

1.2.1.1 反應pH值的確定

DMY在堿性條件下易與金屬離子發生配合反應產生沉淀，但其在強堿作用下會發生徹底的不可逆解環[10]，因此僅考察pH值范圍8.0～10.0。將1.0×10-3mol/L的DMY乙醇溶液與等物質的量濃度等體積的CuCl2-乙醇溶液在帶三口燒瓶(帶攪拌和冷凝)中，在反應溫度40℃和反應時間60min條件下進行試驗，探討pH值對配合反應的影響。反應液中會產生配合物的沉淀，根據離心分離后上清液的OD332nm(332nm是DMY-Cu配合物的特征吸收波長)大小確定最佳反應pH值。上清液于紫外-可見分光光度計中測定其OD332nm值，以其OD332nm值間接反映產率的大小(上清液的OD332nm反應結晶母液中殘留配合物濃度，由于DMY和Cu的配比完全一致，則OD332nm越大，反應溶液中殘留配合物越多，產率越低，下同)。

1.2.1.2 反應時間的確定

試驗方法同上。選取反應時間15、30、45、60min和75min，反應pH 9.5，反應溫度40℃的條件下進行試驗，根據離心分離后上清液的OD332nm大小確定最佳反應時間。

1.2.1.3 反應溫度的確定

試驗方法同上。選取反應溫度40、50、60℃和70℃，在pH9.5，反應時間60min的條件下進行試驗，根據離心分離后上清液的OD332nm大小確定最佳反應溫度。

1.2.2 二氫楊梅素Cu配合物的制備

在帶有攪拌器、干燥管、冷凝管的三口燒瓶中加入0.02mol/L 的DMY的無水乙醇溶液，加入等物質的量的CuCl2的無水乙醇溶液，用5g/100mL的NaOH-乙醇溶液調節pH9.5，于40℃下反應回流lh，產生淺褐色沉淀。反應液冷卻至室溫后在4000r/min離心10min，分離上清液。沉淀先用乙醇洗滌，再用水洗數次，固體產物在40℃真空干燥箱中干燥即可。

1.2.3 量子化學計算[11]

運用Hyperchem 軟件對DMY分子進行結構優化，并進行半經驗的全略微分重疊(CNDO/2)計算，根據分子中各O原子所帶電荷對DMY分子可能配位位點進行預測。

1.2.4 DMY及DMY-Cu對羥自由基的清除作用測定

在25mL比色管中依次加入3mL 2mmol/L Fe3O4、3mL 1mmol/L H2O2溶液，搖勻，再加入3mL 6mmol/L 水楊酸，搖勻，于37℃水浴加熱15min后取出，測其吸光度A0。另取25mL 比色管依次加入3mL 2mmol/L FeSO4、3mL 1mmol/L H2O2溶液，搖勻，分別加入1.5×10-2mol/L待測液0.0、1.0、2.0、3.0mL，于37℃水浴中加熱15min后取出，然后再加入6mmol/L 水楊酸溶液3mL，繼續水浴加熱15min，取出用蒸餾水補充至25mL，搖勻，測其吸光度Ai[12]。

1.2.5 DMY及其Cu配合物的光譜分析和XRD分析

配制DMY及DMY-Cu的乙醇溶液并在200～600nm波長處測定其紫外吸收光譜。取約1mgDMY及其Cu配合物分別與約100mg的KBr在瑪瑙研缽中研磨混合均勻，分別取少許上述混合物倒入壓片模中，用壓片器壓制成透明薄片，進行紅外光譜分析。在相同條件下使用X 射線衍射儀對DMY及其Cu配合物進行分析。實驗條件：Cu靶，40kV，40mA，步長0.02°，掃描速度17.7s/步。

2 結果與分析

2.1 不同工藝條件對配合反應的影響

2.1.1 pH值對配合反應的影響

圖2 pH值對配合反應的影響Fig.2 Effect of pH on coordination reaction

由圖2可知，pH值對配合反應的影響較大，pH值在8.0～9.0間變化，上清液的OD332nm值急劇下降，說明在堿性條件下有利于配合反應進行，DMY-Cu配合物產率升高；pH 9.5時OD332nm值達到最小，產率達到最大；但當pH值超過9.5時上清液的OD332nm值又開始上升，分析其原因可能是由于pH值過高，DMY的分子結構遭到破壞，配合反應不能順利進行導致產率下降。

2.1.2 溫度對配合反應的影響

圖3 溫度對配合反應的影響Fig.3 Effect of temperature on coordination reaction

由圖3可知，反應溫度為40℃，溫度升高配合反應正向進行，產率增加；反應溫度在40～60℃范圍內時，轉化率雖增加，但配合物溶解度增加，沉淀量下降，產量下降，這可同任志秋等[13]的結果相驗證；反應溫度達到70℃后，高溫下配合物可能不穩定，變成其他物質，產率下降。

2.1.3 時間對配合反應的影響

圖4 時間對配合反應的影響Fig.4 Effect of time on coordination reaction

由圖4可知，在15～60min的反應時間范圍內，隨著反應時間的增加，上清液的OD332nm值逐漸減小，在60min時達到最小值，此時產率達到最大；隨著反應時間的進一步增加，上清液的OD332nm值略有增加，產率逐漸降低，分析其原因可能是隨著反應時間的延長，出現一定程度的逆反應。

2.2 DMY及其Cu配合物的紫外-可見光譜分析

圖5 DMY及DMY-Cu的紫外可見光譜圖Fig.5 UV-visible spectra of DMY and DMY-Cu complex

由圖5可知，DMY在292nm波長處有最大吸收，與Cu配位后，其在332nm波長處出現最大吸收，特征吸收峰發生40nm紅移現象，說明有DMY-Cu配合產物的生成。

2.3 DMY及其Cu配合物的紅外光譜分析

圖6 DMY及DMY-Cu配合物的紅外光譜Fig.6 FT infrared spectra of DMY and DMY-Cu complex

由圖6可知，DMY-Cu配合物在3300～3500cm-1處有強吸收峰，這是O-H的特征峰，說明配合物中酚羥基的存在，但吸收峰的寬度沒有DMY寬，說明DMY-Cu配合物中酚羥基數可能比DMY中少；DMY-Cu配合物在1467cm-1處仍存在強吸收峰，在芳環骨架振動C＝C頻率區1450～1600cm-1內，說明DMY-Cu苯環結構還存在；分子中C-O-C鍵的振動頻率(1050～1250cm-1)基本未變，表明DMY的C環醚鍵在選用配位條件下未發生開環；DMY在1644cm-1處有強吸收峰，這是4位羰基產生的強吸收峰，DMY和Cu形成DMY-Cu后，由于金屬的配合作用，降低了4位羰基上碳氧原子的電子云密度，使碳氧雙鍵減弱，吸收峰的位置移至1626cm-1處。同時，在指紋區601cm-1處出現新的強吸收峰，這是M-O鍵的吸收峰，說明確實有DMY-Cu配合物的生成。

2.4 DMY配位位點的量子化學計算分析

圖7 計算后DMY分子的化學結構Fig.7 Chemical structure of DMY after theoretical quantum chemistry calculation

由圖7可知，4位羰基O原子所帶電荷為-0.319(相對電荷，相當于一個電子所帶電荷的0.319倍，下同)，在8個O原子的電荷值中最大，故預測DMY分子中4位羰基O原子肯定參與了配位，這可從2.3節的紅外光譜分析中得到驗證。另外，3位羥基和5位羥基O原子電荷值分別為-0.291和-0.278，明顯大于其他O原子電荷值，故3位和5位羥基O原子是可能的配位位點。據文獻[10]和[14]報道，DMY能以4位羰基和5位羥基與Zn和Cu配位，DMY與Cu配位的物質的量比為1:1，以4位羰基和5位羥基與Cu配位, 這與A環和4位羰基的π-π共軛有關。

2.5 DMY及DMY-Cu的XRD分析

圖8 DMY及其Cu配合物的衍射圖譜Fig.8 XRD spectra of DMY and DMY-Cu complex

由圖8可知，DMY在2θ為11.376°、14.589°和22.948°處有強衍射峰，而DMY-Cu的特征衍射峰出現在2θ為28.982°、33.787°處，而DMY在此處卻無衍射峰，說明DMY與Cu發生了配位反應。而且，DMY和Cu配位后，出現彌散衍射特征，而DMY的XRD圖中僅有尖峰衍射特征，說明DMY與Cu配位后出現非晶化現象[15]。

2.6 DMY及DMY-Cu對羥自由基的清除作用測定

圖9 DMY及DMY-Cu配合物對·OH的清除率Fig.9 Scavenging rates of DMY and DMY-Cu against hydroxyl free radicals

由圖9可知，DMY及DMY-Cu對·OH有很好的清除效果，且清除效果隨濃度的增大而增大。當濃度在1.5×10-2mol/L時，兩者的清除率是一樣的，但當濃度大于1.5×10-2mol/L時，DMY-Cu的清除效果優于DMY。分析其原因可能是DMY-Cu配合物有類似超氧化物歧化酶(SOD)的活性，并消除了金屬離子對自由基氧化的催化作用；另外，DMY與Cu配位后的非晶化現象也是可能的原因。

3 結 論

3.1 通過單因素試驗確定DMY-Cu配合反應的最佳工藝條件是溫度40℃、pH9.5、反應時間為60min。

3.2 UV-Vis、XRD、FT-IR和理論量子化學計算分析結果表明，DMY的5位羥基和4位羰基與Cu發生非晶化配位。在實驗條件下，DMY的C環沒有開環，還有部分羥基未參與配位。

3.3 實驗證明DMY-Cu配合物對·OH具有很好的清除能力，且清除效果明顯優于DMY，即與DMY-Cu配合物的抗氧化能力優于DMY。這可能DMY配位后的非晶化以及DMY-Cu有類似超氧化物歧化酶活性有關。

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Effect of Coordination on Crystal Structure and Antioxidant Activity of Dihydromyricetin

YU Si-ming，ZHU Si-ming*，YU Shu-juan，LIN Jing-cong，XU Min
(College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

Non-crystallization coordination of bioactive ingredients in edible plants can generate new or better pharmacological activity. In this paper, the optimal reaction conditions between dihydromyricetin (DMY) and Cu2+, the effect of coordination on the crystal structure and antioxidant activity of DMY were investigated. Results indicated that the optimal reaction conditions were reaction temperature of 40 ℃, reaction time of 60 min and reaction pH of 9.5. The characteristic absorption peaks were 332 nm for DMY-Cu complex and 292 nm for DMY, which may be ascribed to the oxygen from 4 carbonyl and 5 hydroxyl groups participated in coordination according to FT-IR analysis and theoretical chemical calculation of DMY or its complex. In addition, the scavenging capability of DMY against hydroxyl free radicals (·OH) was increased due to the non-crystallization coordination according to XRD analysis of DMY and its complex.

DMY；Cu；complex；antioxidation

O623.54

A

1002-6630(2011)07-0034-04

2010-05-26

廣東省科技計劃項目 (2008A080403009)；2008—2009年度學生研究計劃(SRP)項目(Y1090070)

俞思明(1985—)，男，碩士研究生，主要從事制糖工程研究。E-mail：tayiya@126.com

*通信作者：朱思明(1976—)，男，講師，博士，主要從事植物有效成分的資源利用和化學改性研究。

E-mail：lfsmzhu@scut.edu.cn