不同脂肪酸對(duì)桑黃液體發(fā)酵的影響

高興喜，姚 強(qiáng)*，宮志遠(yuǎn)，郎 曉，任鵬飛，劉 巖

(1.魯東大學(xué)菌物科學(xué)與技術(shù)研究院，山東 煙臺(tái) 264025；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，山東 濟(jì)南 250100；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266109)

不同脂肪酸對(duì)桑黃液體發(fā)酵的影響

高興喜1，姚 強(qiáng)2,*，宮志遠(yuǎn)2，郎 曉1，任鵬飛2，劉 巖3

(1.魯東大學(xué)菌物科學(xué)與技術(shù)研究院，山東 煙臺(tái) 264025；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，山東 濟(jì)南 250100；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266109)

考察不同種類及質(zhì)量濃度的脂肪酸對(duì)桑黃液體發(fā)酵的影響。結(jié)果表明：脂肪酸對(duì)桑黃菌體生長(zhǎng)以及多糖、三萜和黃酮類物質(zhì)的合成的影響隨脂肪酸種類以及質(zhì)量濃度的不同而表現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)。油酸有利于桑黃生物量的積累，在質(zhì)量濃度為2.0g/L時(shí)，使桑黃生物量達(dá)到1.24g/L，比對(duì)照提高了33.33%；而硬脂酸則有利于桑黃胞外多糖的產(chǎn)生，在質(zhì)量濃度2.0g/L時(shí)，使胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到325.38mg/L，是對(duì)照的3.20倍。對(duì)胞內(nèi)多糖而言，油酸和硬脂酸誘導(dǎo)效果較好，分別在質(zhì)量濃度0.5g/L和1.0g/L時(shí)，使產(chǎn)量達(dá)到645.79mg/L和655.12mg/L，而亞油酸則在高質(zhì)量濃度時(shí)才表現(xiàn)出較好的誘導(dǎo)效果。對(duì)于桑黃三萜的生產(chǎn)而言，油酸無(wú)論是對(duì)胞外三萜還是胞內(nèi)三萜，都表現(xiàn)出較好的誘導(dǎo)效果，并分別在質(zhì)量濃度1.5g/L和2.0g/L時(shí)，使胞外三萜和胞內(nèi)三萜產(chǎn)量達(dá)到666.15mg/L和339.32mg/L，分別為對(duì)照的1.28倍和2.30倍。此外，亞油酸還對(duì)胞內(nèi)三萜的生產(chǎn)表現(xiàn)出較好的誘導(dǎo)效果。對(duì)于黃酮類物質(zhì)的合成，本實(shí)驗(yàn)所考察的這幾種脂肪酸均未表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用。

桑黃；脂肪酸；多糖；三萜類物質(zhì)；黃酮類物質(zhì)

桑黃(Phellinus igniarius)俗稱桑黃菇、桑臣、桑耳等，是一種珍貴的大型藥用真菌。目前，桑黃是國(guó)際公認(rèn)的生物抗癌領(lǐng)域中效果最好的真菌[1]。桑黃具有抗癌、抗炎、抗氧化、提高免疫力、保肝護(hù)肝等多種藥用功效[2-5]，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，三萜、多糖和黃酮類物質(zhì)是其關(guān)鍵藥性成分[6]。目前，桑黃在國(guó)際市場(chǎng)上供不應(yīng)求，野生桑黃資源有限，桑黃的人工栽培研究在國(guó)內(nèi)又剛剛起步，因此，采用液體發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行桑黃的規(guī)模化生產(chǎn)具有廣闊的前景[7]。

桑黃液體發(fā)酵研究已有較多報(bào)道[8-10]，但活性物質(zhì)產(chǎn)量偏低仍是限制其應(yīng)用的主要瓶頸，因此，提高桑黃液體發(fā)酵效率成為人們研究的一個(gè)熱點(diǎn)。有研究表明，向培養(yǎng)基中添加脂肪酸或油脂類物質(zhì)能夠促進(jìn)牛肝菌、香菇和平菇等菌絲的生長(zhǎng)[11-14]。研究人員還發(fā)現(xiàn)，脂肪酸或油脂還能促進(jìn)靈芝、米曲霉等真菌產(chǎn)生多糖和黃曲霉毒素等代謝產(chǎn)物[15-17]。本實(shí)驗(yàn)考察幾種脂肪酸對(duì)桑黃液體發(fā)酵的影響，擬為提高桑黃活性物質(zhì)的液體發(fā)酵生產(chǎn)探索一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

棕櫚酸、油酸、硬脂酸、亞油酸 上海晶純實(shí)業(yè)有限公司；香蘭素、蘆丁、齊墩果酸 上海生工生物工程服務(wù)有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 菌株與培養(yǎng)基

桑黃(Phellinus igniarius，菌株編號(hào)：CGMCC 5.95)購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

菌株活化培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，擴(kuò)大培養(yǎng)和液體發(fā)酵培養(yǎng)基均為PDB培養(yǎng)基。

1.3 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

將于PDA平板上活化好的桑黃菌株，打取直徑0.5cm菌塊接入PDB培養(yǎng)基(500mL三角瓶裝有150mL PDB培養(yǎng)基)于搖床25℃、150r/min振蕩培養(yǎng)7d左右制備液體菌種。

設(shè)棕櫚酸、油酸、硬脂酸、亞油酸4種脂肪酸每種5個(gè)質(zhì)量濃度梯度：0、0.5、1.0、1.5、2.0g/L，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，分別配制PDB發(fā)酵培養(yǎng)基。按10%的接種量依次接入桑黃液體菌種，置于25℃、150r/min的搖床中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)7d左右結(jié)束發(fā)酵。

1.4 活性物質(zhì)的提取與檢測(cè)

多糖的提取與檢測(cè)參照文獻(xiàn)[18]方法進(jìn)行；三萜的提取與檢測(cè)參照文獻(xiàn)[19]方法進(jìn)行；黃酮類物質(zhì)的提取與檢測(cè)參照文獻(xiàn)[20]方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酸對(duì)桑黃菌體生物量的影響

發(fā)酵結(jié)束后，過(guò)濾收集各處理組桑黃菌體并用去離子水洗滌3次，然后置于60℃烘箱中烘干至質(zhì)量恒定，測(cè)定其生物量，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同脂肪酸對(duì)桑黃菌體生物量的影響Fig.1 Effect of different fatty acids on the biomass of Phellinus igniarius

如圖1所示，不同脂肪酸對(duì)桑黃生物量的影響呈現(xiàn)不同變化趨勢(shì)，其中油酸在各檢測(cè)質(zhì)量濃度都能促進(jìn)桑黃菌體生物量的增加，且與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)性，但當(dāng)油酸質(zhì)量濃度達(dá)到1.5g/L時(shí)，生物量增加趨勢(shì)變緩，當(dāng)油酸質(zhì)量濃度達(dá)到2.0g/L時(shí)，桑黃生物量達(dá)到1.24g/L，比對(duì)照(不加脂肪酸，即脂肪酸質(zhì)量濃度為0時(shí))提高了33.33%。棕櫚酸和亞油酸在低質(zhì)量濃度時(shí)(＜1.5g/L)對(duì)桑黃生物量促進(jìn)作用不明顯，甚至表現(xiàn)為抑制作用，而在質(zhì)量高濃度時(shí)則體現(xiàn)出較強(qiáng)的促進(jìn)作用，當(dāng)質(zhì)量濃度為2.0g/L時(shí)，棕櫚酸和亞油酸處理組桑黃生物量分別達(dá)到1.31g/L和1.18g/L，比對(duì)照組分別提高了40.86%和26.88%。而硬脂酸則只在低質(zhì)量濃度表現(xiàn)為促進(jìn)作用，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1.0g/L以上時(shí)，則對(duì)桑黃生物量表現(xiàn)為抑制作用。

2.2 脂肪酸對(duì)桑黃多糖的影響

2.2.1 脂肪酸對(duì)桑黃胞外多糖的影響

圖2 不同脂肪酸對(duì)桑黃胞外多糖的影響Fig.2 Effect of different fatty acids on the production of EPS in Phellinus igniarius

脂肪酸不同，對(duì)桑黃胞外多糖的作用效果也不同。從圖2可以看出，棕櫚酸、油酸和硬脂酸都能促進(jìn)桑黃胞外多糖的產(chǎn)生，且與各脂肪酸的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)性，其中對(duì)桑黃胞外多糖生產(chǎn)誘導(dǎo)效果最好的是硬脂酸，其次為棕櫚酸和油酸，在質(zhì)量濃度2.0g/L時(shí)相應(yīng)胞外多糖產(chǎn)量分別達(dá)到325.38、245.11mg/L和174.58mg/L，為對(duì)照組的3.20、2.41倍和1.72倍。而亞油酸對(duì)桑黃胞外多糖合成影響的規(guī)律性不明顯，其最佳誘導(dǎo)質(zhì)量濃度為1.0g/L，但與其他幾種脂肪酸相比，作用效果較弱。

2.2.2 脂肪酸對(duì)桑黃胞內(nèi)多糖的影響

圖3 不同脂肪酸對(duì)桑黃胞內(nèi)多糖的影響Fig.3 Effect of different fatty acids on the production of IPS in Phellinus igniarius

脂肪酸對(duì)桑黃胞內(nèi)多糖生產(chǎn)的作用效果與胞外多糖相比，促進(jìn)作用不十分顯著。從圖3可以看出，油酸和硬脂酸在低質(zhì)量濃度(0.5～1.5g/L)時(shí)對(duì)桑黃胞內(nèi)多糖的產(chǎn)生表現(xiàn)為一定的誘導(dǎo)作用，分別于質(zhì)量濃度0.5g/L和1.0g/L時(shí)使胞內(nèi)多糖產(chǎn)量達(dá)到645.79mg/L和655.12mg/L，與對(duì)照組相比分別提高了20.28%和22.24%，但隨著質(zhì)量濃度的升高，誘導(dǎo)效果逐漸下降；而亞油酸和棕櫚酸則在低質(zhì)量濃度(0.5～1.5g/L)時(shí)對(duì)胞內(nèi)多糖的生產(chǎn)表現(xiàn)為強(qiáng)烈的抑制作用，但在高質(zhì)量濃度(2.0g/L)時(shí)則具有一定的促進(jìn)作用，特別是亞油酸，使桑黃胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量達(dá)到820.04mg/L，比對(duì)照組提高了52.73%。

2.3 脂肪酸對(duì)桑黃三萜類物質(zhì)的影響

2.3.1 脂肪酸對(duì)桑黃胞外三萜類物質(zhì)的影響

圖4 不同脂肪酸對(duì)桑黃胞外三萜的影響Fig.4 Effect of different fatty acids on the production of EGT in Phellinus igniarius

除硬脂酸外，其余3種脂肪酸都能在一定程度上促進(jìn)桑黃胞外三萜的產(chǎn)生，結(jié)果見(jiàn)圖4。桑黃胞外多糖的產(chǎn)生與油酸、棕櫚酸和亞油酸的質(zhì)量濃度呈現(xiàn)一定的相關(guān)性，總體趨勢(shì)都是隨著脂肪酸的質(zhì)量濃度先升高再降低而變化，其中油酸對(duì)桑黃胞外三萜的誘導(dǎo)效果最好，當(dāng)質(zhì)量濃度為1.5g/L時(shí)，胞外三萜產(chǎn)量最高達(dá)666.15mg/L，是對(duì)照組的1.28倍；而棕櫚酸和亞油酸則在質(zhì)量濃度為0.5g/L時(shí)誘導(dǎo)效果最好，但與油酸相比，其誘導(dǎo)作用要遜色很多。在本實(shí)驗(yàn)中，硬脂酸對(duì)桑黃三萜的生產(chǎn)不但沒(méi)有促進(jìn)作用，反而表現(xiàn)為較強(qiáng)的抑制作用。

2.3.2 脂肪酸對(duì)桑黃胞內(nèi)三萜類物質(zhì)的影響

圖5 不同脂肪酸對(duì)桑黃胞內(nèi)三萜的影響Fig.5 Effect of different fatty acids on the production of IGT in Phellinus igniarius

不同脂肪酸對(duì)桑黃胞內(nèi)三萜的影響呈現(xiàn)出與胞外三萜不同的變化趨勢(shì)，結(jié)果見(jiàn)圖5，對(duì)桑黃胞內(nèi)三萜生產(chǎn)誘導(dǎo)效果較好的脂肪酸是亞油酸和油酸，而且隨著兩者質(zhì)量濃度的不斷升高，誘導(dǎo)作用不斷增強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到2.0g/L時(shí)，桑黃胞內(nèi)三萜產(chǎn)量分別達(dá)到361.07mg/L和339.32mg/L，分別為對(duì)照組的2.45倍和2.30倍。而另外兩種脂肪酸硬脂酸和棕櫚酸則在各檢測(cè)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)桑黃胞內(nèi)三萜的生產(chǎn)表現(xiàn)為抑制作用。

2.4 脂肪酸對(duì)桑黃黃酮類物質(zhì)的影響

圖6 不同脂肪酸對(duì)桑黃黃酮類物質(zhì)的影響Fig.6 Effect of different fatty acids on the production of flavonoids in Phellinus igniarius

桑黃是少有的可產(chǎn)生黃酮類物質(zhì)的藥用真菌。如圖6所示，所考察的幾種脂肪酸對(duì)桑黃黃酮的誘導(dǎo)效果均不理想，在低質(zhì)量濃度時(shí)都表現(xiàn)為抑制作用，只有在較高質(zhì)量濃度時(shí)才表現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用，如亞油酸和棕櫚酸質(zhì)量濃度分別在2.0g/L時(shí)，使黃酮的產(chǎn)量達(dá)到221.88mg/L和223.82mg/L，分別比對(duì)照組提高了3.30%和4.18%；而硬脂酸和油酸這兩種脂肪酸即使在高質(zhì)量濃度時(shí)，對(duì)桑黃黃酮的誘導(dǎo)作用也極為有限。因此，總體來(lái)看，向培養(yǎng)基中添加脂肪酸并不能有效提高桑黃黃酮的產(chǎn)量。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)考察棕櫚酸、油酸、硬脂酸、亞油酸這4種脂肪酸對(duì)桑黃液體發(fā)酵活性成分生產(chǎn)的影響，得出如下結(jié)論：1)硬脂酸可顯著促進(jìn)桑黃胞外多糖的產(chǎn)生，油酸和硬脂酸在一定程度上促進(jìn)了胞內(nèi)多糖的產(chǎn)生，但作用效果較弱。2)對(duì)于三萜類物質(zhì)的生產(chǎn)，油酸無(wú)論是對(duì)胞外三萜還是胞內(nèi)三萜，都表現(xiàn)出較好的誘導(dǎo)作用。3)對(duì)于黃酮類物質(zhì)的生產(chǎn)，本實(shí)驗(yàn)所考察的幾種脂肪酸均未表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用。

近年來(lái)，通過(guò)液體深層發(fā)酵的方法生產(chǎn)真菌多糖、三萜類物質(zhì)等活性成分的研究方興未艾。為了提高生產(chǎn)效率，人們廣泛采用優(yōu)化環(huán)境條件或者培養(yǎng)基組成等策略[21]。在真菌多糖液體發(fā)酵生產(chǎn)中，通常會(huì)伴隨β-葡聚糖而產(chǎn)生大量的氣泡，人們?cè)谟靡恍┲舅?植物油)作為消泡劑時(shí)卻意外地發(fā)現(xiàn)這些脂肪酸能夠促進(jìn)多糖的產(chǎn)生[16,22]，于是，人們開始嘗試用脂肪酸作為一種誘導(dǎo)因子來(lái)促進(jìn)某些真菌特定活性成分的生產(chǎn)。

羅潔等[14]在研究不同脂肪酸對(duì)平菇菌絲生長(zhǎng)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，不飽和脂肪酸更有利于平菇菌絲的生長(zhǎng)，和本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)論類似，油酸和亞油酸相對(duì)于飽和脂肪酸(硬脂酸)對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)具有更好的誘導(dǎo)效果。但各脂肪酸對(duì)桑黃多糖和三萜類物質(zhì)等活性成分生產(chǎn)的影響，卻因脂肪酸的種類不同而表現(xiàn)出較為復(fù)雜的變化。例如，對(duì)于胞外多糖的生產(chǎn)，硬脂酸誘導(dǎo)效果最好，而對(duì)于胞內(nèi)多糖的生產(chǎn)，油酸的誘導(dǎo)效果較好。同樣，對(duì)于桑黃三萜類物質(zhì)的生產(chǎn)，也因脂肪酸的種類和濃度不同而體現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)。Yang等[17]在研究不同脂肪酸對(duì)靈芝菌絲生長(zhǎng)和多糖生產(chǎn)時(shí)，也發(fā)現(xiàn)脂肪酸鏈的長(zhǎng)短以及飽和度不同，對(duì)靈芝的生長(zhǎng)或多糖的生產(chǎn)表現(xiàn)為促進(jìn)或抑制作用，并推測(cè)其可能機(jī)制是因?yàn)殪`芝細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)以及滲透性的不同所致，但確切的機(jī)制還有待于以后深入研究。另外，本實(shí)驗(yàn)所考察的幾種脂肪酸對(duì)桑黃黃酮類物質(zhì)的生產(chǎn)沒(méi)有體現(xiàn)出促進(jìn)作用，這一方面可能是因?yàn)樗疾斓闹舅岱N類有限，未能找出適宜的脂肪酸，另一方面也可能是因?yàn)樵谂囵B(yǎng)基中添加脂肪酸不利于黃酮類物質(zhì)的合成。

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Effect of Different Fatty Acids on Liquid-state Fermentation of Phellinus igniarius

GAO Xing-xi1，YAO Qiang2,*，GONG Zhi-yuan2，LANG Xiao1，REN Peng-fei2，LIU Yan3
(1. Institute of Mycological Science and Technology, Ludong University, Yantai 264025, China；2. Soil and Fertilizer Institute, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, China；3. School of Life Sciences, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China)

The fatty acids palmitic acid, oleic acid, stearic acid and linoleic acid were separately added to the liquid culture medium for Phellinus igniarius to investigate their effects on the production of biomass, polysaccharides, triterpenoids and flavonoids during shake culture. The results indicated that the extent of stimulation or inhibition on the production of biomass, polysaccharides, triterpenoids and flavonoids were associated with the types and levels of added fatty acids. Oleic acid at the concentration of 2.0 g/L led to a significant increase in biomass to 1.24 g/L, which was 33.33% higher than that of the control. Stearic acid was of great advantage for extracellular polysaccharide (EPS) production, and increased the yield to 325.38 mg/L, which was 3.20 times higher than that of the control. As for intracellular polysaccharide (IPS) production, oleic acid and stearic acid were both good elicitors, and increased the yield to 645.79 mg/L and 655.12 mg/L, respectively, and a much better stimulation was observed from linoleic acid at a higher concentration of 2.0 g/L. In addition, oleic acid was beneficial to the production of either extracellular triterpenoids (EGT) at 1.5 g/L concentration or intracellular triterpenoids (IGT) at 2.0 g/L concentration, and increased their yields to 666.15 mg/L and 339.32 mg/L, respectively. However, linoleic acid showed positive effect only on the production of IGT. In contrast, no satisfied results were gotten for the production of flavonoids from P. igniarius in this study.

Phellinus igniarius；fatty acids；polysaccharide；triterpenoids；total flavonoids

Q93.335

A

1002-6630(2011)07-0198-04

2010-07-25

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(Q2008D02；ZR2010CL020)；“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2007BAD89B09-11)；山東省農(nóng)業(yè)良種工程項(xiàng)目(2007LZ06-3)；“泰山學(xué)者”建設(shè)工程專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目；魯東大學(xué)食(藥)用真菌創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目

高興喜(1972—)，男，副教授，博士，主要從事高等真菌分子生物學(xué)與代謝生理研究。E-mail：gaoxingxi@yahoo.com.cn

*通信作者：姚強(qiáng)(1979—)，男，助理研究員，博士，主要從事分子育種、微生物生理生化研究。E-mail：qyaomail@163.com