均勻設(shè)計法優(yōu)化廉價型牛凝乳酶工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基

袁 偉，惠豐立*，柯 濤，程民杰，趙金梅

(1.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007；2.南陽師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，河南 南陽 473061)

均勻設(shè)計法優(yōu)化廉價型牛凝乳酶工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基

袁 偉1,2，惠豐立2,*，柯 濤2，程民杰2，趙金梅2

(1.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007；2.南陽師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，河南 南陽 473061)

為了獲得生產(chǎn)用廉價型牛凝乳酶工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基，通過單因素試驗考察發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分對產(chǎn)酶的影響。結(jié)果顯示：葡萄糖、玉米漿、酵母提取物、尿素質(zhì)量濃度對產(chǎn)酶影響顯著。以上述因素作為隨機因子，進(jìn)行均勻設(shè)計試驗，采用逐步回歸方法對試驗結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果表明：在葡萄糖45g/L、玉米漿17g/L、酵母提取物6g/L、尿素12g/L的條件下，凝乳酶活性達(dá)342.86SU/mL，比優(yōu)化前提高了1.22倍。所得培養(yǎng)基為重組牛凝乳酶的高效低成本生產(chǎn)提供了參考。

凝乳酶；工程菌；均勻設(shè)計；培養(yǎng)基

凝乳酶是從未斷奶的小牛皺胃中提取的一種天冬氨酸蛋白酶，它可以特異性裂解牛乳中的κ-酪蛋白的Phe105-Met106之間肽鍵，導(dǎo)致牛乳凝結(jié)，因此被廣泛用于干酪制造業(yè)[1-2]。凝乳酶是世界第二大酶制劑，其產(chǎn)量占全世界酶制劑總量的15%[3]。傳統(tǒng)的凝乳酶是通過宰殺未斷奶小牛，從其皺胃中提取的。隨著小牛數(shù)量的逐年減少，這種傳統(tǒng)而昂貴的制備方法已無法滿足世界干酪需求量不斷增長的需要。

利用微生物生物工程技術(shù)生產(chǎn)凝乳酶可以獲得高純度的凝乳酶，生產(chǎn)成本低，來源穩(wěn)定[3]。目前全世界用于干酪生產(chǎn)的凝乳酶約50%以上是生物工程酶制劑，生物工程凝乳酶也得到了消費者的廣泛接受[4-9]。我國尚無凝乳酶生物工程產(chǎn)品的生產(chǎn)，除少量從小牛皺胃中提取外，干酪生產(chǎn)所用凝乳酶主要依賴進(jìn)口。凝乳酶匱缺已成為制約我國干酪生產(chǎn)的重要因素。

本實驗室已成功將小牛凝乳酶原基因與乳酸克魯維酵母表達(dá)載體pKLAC1相連接形成重組質(zhì)粒pKLAC1-Prochy，并將其轉(zhuǎn)化至非營養(yǎng)缺陷型工業(yè)菌株乳酸克魯維酵母GG799中，獲得了具有分泌表達(dá)重組凝乳酶能力的基因工程菌Chy1。培養(yǎng)基組成是決定重組凝乳酶經(jīng)濟(jì)可行的關(guān)鍵因素之一。由于目前多數(shù)生物工程凝乳酶生產(chǎn)培養(yǎng)基采用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏等基質(zhì)[5-7]，但這些材料的價格較高，導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高。因此篩選廉價型培養(yǎng)基，對于降低生產(chǎn)成本、提高生產(chǎn)效益具有重要意義。

均勻設(shè)計是在正交設(shè)計的基礎(chǔ)上發(fā)明的一種新的設(shè)計方法。其特點是不考慮整齊可比性，而且完全保證均勻性，讓實驗點在實驗范圍內(nèi)充分的均勻分散，這樣可以大大減少實驗點，且仍能得到反映實驗體系主要特征的實驗結(jié)果[10]。近年來采用均勻設(shè)計法對發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化已有一些報道，并取得了較好的優(yōu)化結(jié)果[11-14]。前期通過大量實驗已篩選到適合牛凝乳酶工程菌發(fā)酵的主要培養(yǎng)基成分，如玉米漿、酵母提取物、尿素等，本實驗進(jìn)一步在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用均勻設(shè)計法優(yōu)化牛凝乳酶工程菌發(fā)酵的廉價培養(yǎng)基組成，以提高其酶活性，為規(guī)模化生產(chǎn)凝乳酶提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

牛凝乳酶重組菌株Chy1，由本實驗室構(gòu)建。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20、蛋白胨20、酵母粉10、瓊脂20，pH5.8～6.0；種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20、蛋白胨20、酵母粉10，pH5.8～6.0；發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖40、玉米漿20、酵母膏5、尿素15。

1.3 培養(yǎng)方法及培養(yǎng)條件

挑取單菌落轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基，待長出豐滿菌落后挑取一環(huán)接種于50mL種子培養(yǎng)基中，200r/min、28℃搖床培養(yǎng)20h，再以10%的接種量接入50mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中(250mL搖瓶)，180r/min、28℃搖床培養(yǎng)96h。

1.4 重組凝乳酶活性檢測

將重組酵母培養(yǎng)液以3000r/min離心5min，上清液pH值用1mol/L H2SO4調(diào)整至2，室溫條件下放置2h，然后用2mol/L Tris將上清液的pH值調(diào)至6，用于凝乳酶活性的檢測。

采用Arima等[15]的方法進(jìn)行凝乳酶活性的測定。用0.01mol/L CaCl2溶液配制10g/100mL脫脂乳。此溶液配制后在室溫下放置40min后使用，取5mL 10g/100mL脫脂乳于35℃保溫10min，加入適量稀釋的酶制劑，振蕩均勻并開始計時，觀察管壁上開始出現(xiàn)凝乳顆粒為終點，記錄凝乳時間(t)。在上述條件下，40min凝結(jié)1mL 10g/100mL脫脂乳的酶量定義為一個Soxhlet單位(SU)。

1.5 實驗設(shè)計

1.5.1 單因素試驗

根據(jù)前期大量實驗篩選到適合牛凝乳酶工程菌發(fā)酵的主要培養(yǎng)基成分，以凝乳酶活性為考核指標(biāo)，確定葡萄糖、玉米漿、酵母提取物、尿素對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響及適宜質(zhì)量濃度范圍。

1.5.2 均勻設(shè)計試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇葡萄糖質(zhì)量濃度X1、玉米漿質(zhì)量濃度X2、酵母提取物質(zhì)量濃度X3、尿素質(zhì)量濃度X44個因素水平構(gòu)建U10(1010)(中心偏差CD=0.12597)進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化試驗，用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 葡萄糖質(zhì)量濃度對酶活性的影響

葡萄糖質(zhì)量濃度分別為10、20、30、40、50g/L，研究葡萄糖質(zhì)量濃度對酶活性的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 葡萄糖質(zhì)量濃度對酶活性的影響Fig.1 Effect of glucose concentration on chymosin activity

由圖1可見，葡萄糖發(fā)酵凝乳酶的最佳質(zhì)量濃度是30g/L。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度小于30g/L時，隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的增加，凝乳酶的酶活性急劇增加，在30g/L時達(dá)到最大；而葡萄糖質(zhì)量濃度大于30g/L時，隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的增加，凝乳酶活性呈下降趨勢。分析原因可能是碳源過多對凝乳酶的酶活性產(chǎn)生了抑制作用。

2.1.2 玉米漿質(zhì)量濃度對酶活性的影響

玉米漿質(zhì)量濃度分別為 15、20、25、30、35g/L，考察玉米漿質(zhì)量濃度變化對酶活性的影響，結(jié)果見圖2。當(dāng)玉米漿的質(zhì)量濃度提高時，體系營養(yǎng)增加，有利于菌體生長繁殖，使得發(fā)酵液中凝乳酶活性增加；但玉米漿的質(zhì)量濃度超過25g/L時，致使加入的營養(yǎng)過多，抑制了菌體生長從而影響了凝乳酶的酶活性。因此玉米漿的最佳質(zhì)量濃度為25g/L。

圖2 玉米漿質(zhì)量濃度對酶活性的影響Fig.2 Effect of corn syrup concentration on chymosin activity

2.1.3 酵母提取物質(zhì)量濃度對酶活性的影響

對酵母提取物的質(zhì)量濃度進(jìn)行了研究，設(shè)酵母提取物的質(zhì)量濃度分別是4、6、8、10、12g/L，實驗結(jié)果見圖3。

圖3 酵母提取物質(zhì)量濃度對酶活性的影響Fig.3 Effect of yeast extract concentration on chymosin activity

從圖3可以看出，當(dāng)酵母提取物的質(zhì)量濃度范圍在4～8g/L時，隨著酵母提取物質(zhì)量濃度的增加，凝乳酶活性增加很快；酵母提取物的質(zhì)量濃度為8g/L時，凝乳酶的酶活性最高為169.52SU/mL；而當(dāng)酵母提取物的質(zhì)量濃度大于8g/L時，凝乳酶活性呈下降趨勢。

2.1.4 尿素質(zhì)量濃度對酶活性的影響

圖4 尿素質(zhì)量濃度對酶活性的影響Fig.4 Effect of urea concentration on chymosin activity

設(shè)定尿素的質(zhì)量濃度分別是5、10、15、20、25g/L，尿素質(zhì)量濃度對酶活性影響的實驗結(jié)果如圖4所示。尿素的質(zhì)量濃度在15g/L時，酶活性最高；質(zhì)量濃度低于15g/L時，凝乳酶活性隨著尿素質(zhì)量濃度的增加而顯著增加，而高于15g/L時凝乳酶活性反而降低。因此尿素的最佳質(zhì)量濃度是15g/L。

2.2 均勻設(shè)計優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基

2.2.1 回歸模型

為進(jìn)一步探討葡萄糖質(zhì)量濃度、玉米漿質(zhì)量濃度、酵母提取物質(zhì)量濃度、尿素質(zhì)量濃度4個參數(shù)及其交互作用對凝乳酶的酶活性的影響，以凝乳酶的酶活性為考核指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化試驗。表1為優(yōu)化試驗方案與結(jié)果。

表1 U10(1010)試驗方案與試驗結(jié)果Table 1 Scheme and results of uniform design

利用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析處理，得到凝乳酶活性與各因素的回歸方程為：Y=1294.9＋246.75X1-532.54X2-2312.9X3＋1.6264X4-26.151X12＋103.48X22＋1343.5X32-19.578X42。其中相關(guān)系數(shù)R為0.9999，F(xiàn)值為9870，作F檢驗，F(xiàn)＞F0.05(8,1)=238.9，回歸方程顯著。由表2可知，觀測值與擬合值誤差非常小，準(zhǔn)確度高。

表2 回歸方程預(yù)測效果Table 2 Predicted and experimental values of chymosin activity

2.2.2 單因子效應(yīng)分析

根據(jù)回歸方程的通徑系數(shù)分析方法將相關(guān)系數(shù)分解為直接作用系數(shù)和間接作用系數(shù)，以揭示各個因數(shù)對因變量的相對重要性。用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計算X1、X2、X3、X44個參數(shù)對凝乳酶活性通徑系數(shù)為：X1(0.8276)＞X3(-0.3649)＞X2(-0.2834)＞X4(-0.2783)，即在選定的4個參數(shù)中，葡萄糖對酶活性的影響最大，其次是酵母提取物和玉米漿，尿素的影響最小。

2.2.3 參數(shù)優(yōu)化及驗證實驗

通過回歸模型對培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，得到培養(yǎng)基最優(yōu)的試驗條件，葡萄糖45g/L、玉米漿17g/L、酵母提取物6g/L、尿素12g/L，預(yù)期指標(biāo)最大值(339.14±8.18) SU/mL。

為了檢測模型和優(yōu)化結(jié)果的準(zhǔn)確性，配制計算得到的最優(yōu)培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵實驗，3次實驗的平均結(jié)果為342.86SU/mL，在模型允許的誤差范圍之內(nèi)。說明該方法對牛凝乳酶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化是可行的，模型能較好地預(yù)測實際發(fā)酵情況，得到的結(jié)果可以在實踐中應(yīng)用。

3 結(jié) 論

3.1 通過單因素試驗考察了發(fā)酵培養(yǎng)基各組分對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果顯示葡萄糖、玉米漿、酵母提取物、尿素對產(chǎn)酶影響顯著，最佳質(zhì)量濃度分別為葡萄糖30g/L、玉米漿25g/L、酵母提取物8g/L、尿素15g/L。

3.2 應(yīng)用均勻設(shè)計試驗對以上成分進(jìn)行優(yōu)化，分析結(jié)果表明，牛凝乳酶原工程菌最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖45g/L、玉米漿17g/L、酵母提取物6g/L、尿素12g/L。在此培養(yǎng)條件下，乳酶活性達(dá)342.86SU/mL，與模型預(yù)測值非常接近，表明該模型能很好地預(yù)測實際的發(fā)酵情況。

3.3 實驗結(jié)果證明，采用均勻設(shè)計實驗優(yōu)化牛凝乳酶原工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基組分準(zhǔn)確可靠。由于葡萄糖、玉米漿及尿素比乳糖、蛋白胨和酵母膏等基質(zhì)便宜得多。因此，本研究獲得的廉價型培養(yǎng)基具有重要的實際應(yīng)用價值，為化牛凝乳酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供可靠的前提條件。

[1] WILLIAMS M G, WILSHER J, NUGENT P, et al. Mutagenesis, biochemical characterization and X-ray structural analysis of point mutants of bovine chymosin[J]. Protein Eng, 1997, 10(9): 991-997.

[2] MOHANTY A K, MUKHOPADHYAY U K, GROVER S, et al. Bovine chymosin: production by rDNA technology and application in cheese manufacture[J]. Biotechnol Adv, 1999, 17(2/3): 205-217.

[3] THAMES P. Bioteehnolngieal innovation in food processing[M]. England: Butterworth Heinenan Ltd., 2001: 113-145.

[4] CULLEN D, GRAY G L, WILSON L J, et al. Controlled expression and secretion of bovine in Aspergillus nidulans[J]. Nat Biotech, 1987, 5 (3): 369-376.

[5] EMTAGE J S, ANGAL S, DOEL M T, et al. Synthesis of calf prochymosin (prorenmin) in Escherichia coli[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1983, 80 (12): 3671-3675.

[6] MELLOR J. Efficient synthesis of enzymatically active calf chymosin in Saccharomyces cerevisiae[J]. Gene, 1983, 24(1): 1-14.

[7] VANDEN B J A. Kluyveromyces as a host for heterologous gene expression: expression and secretion of prochymosin[J]. Biotechnology, 1990, 8(2): 135-139.

[8] WARD M, WILSON L J, KODAMA K H, et al. Improved production of chymosin in Aspergillus by expression as a glucoamylase-chymosin fusion[J]. Biotechnology, 1990, 8(5): 435-440.

[9] 張莉, 姜媛媛, 張健, 等. 牛凝乳酶基因在畢赤酵母中的重組表達(dá)[J].生物工程學(xué)報, 2009, 25(8): 1160-1165.

[10] 王兆軍. 均勻設(shè)計在參數(shù)設(shè)計中的應(yīng)用[J]. 南開大學(xué)學(xué)報, 2000, 33 (2): 57- 60.

[11] 王劍鋒, 李江, 王璋. 均勻設(shè)計法優(yōu)化煙管菌產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基[J]. 微生物學(xué)通報, 2007, 34(4): 625-628.

[12] 關(guān)亞鵬, 婁忻, 張莉, 等. 均勻設(shè)計法優(yōu)化咪唑立賓發(fā)酵培養(yǎng)基配方[J]. 中國抗生素雜志, 2008, 33(8): 471-473.

[13] 代志凱, 唐嘉婕, 阮征, 等. 均勻設(shè)計優(yōu)化節(jié)桿菌產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶發(fā)酵培養(yǎng)基[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(19): 218-222.

[14] 李永紅, 劉波, 趙宗保, 等. 圓紅冬孢酵母菌發(fā)酵產(chǎn)油脂培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化研究[J]. 生物工程學(xué)報, 2006, 22(4): 650-656.

[15] ARIMA K, YU J, IWASAKI S. Milk-clotting enzyme from Mucor pusillus var. Lindt[M]//PERLMAN G E, LORAND L. Methods in enzymology. New York and London: Academic Press, 1970: 446-459.

Optimization of Fermentation Medium for Genetically Engineered Chymosin Strain by Uniform Design Methodology

YUAN Wei1,2，HUI Feng-li2,*，KE Tao2，CHENG Min-jie2，ZHAO Jin-mei2
(1. College of Life Science, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China；2. College of Life Science and Technology, Nanyang Normal University, Nanyang 473061,China)

In order to obtain a low-cost fermentation medium for recombinant chymosin strain Chy1 in a large scale, the effects of glucose, corn syrup, yeast extract and urea concentration on chymosin production by recombinant chymosin strain Chy1 were explored by single factor tests. The results indicated that the effects of glucose, corn syrup, urea and yeast extract on chymosin production were significant. The optimal fermentation medium was optimized by uniform design tests to be glucose of 45 g/L, corn syrup of 17 g/L, yeast extract of 6 g/L and urea of 12 g/L. Under these optimal conditions, the activity of chymosin can reach up to 342.86 SU/mL, which exhibited a 1.22 fold enhancement when compared with original medium. This optimal fermentation medium provided a basis for massive chymosin production by recombinant chymosin strain Chy1 with high efficiency and low cost.

chymosin；recombinant strain；uniform design methodology；low-cost medium

Q949.9

A

1002-6630(2011)07-0258-04

2010-07-03

河南省科學(xué)技術(shù)廳基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃項目(102300410146)；河南省教育廳自然科學(xué)基金項目(2010A180017)

袁偉(1987—)，男，碩士研究生，主要從事微生物資源與微生物技術(shù)研究。E-mail：microbiology@yeah.net

*通信作者：惠豐立(1965—)，男，教授，主要從事微生物資源與微生物技術(shù)研究。E-mail：huifl@126.com