白蘿卜提取物對大鼠非酒精性脂肪肝的藥效作用

由 宏，郝 睿，趙功玲，朱本忠，朱 毅,*，羅云波

(1.中國農業大學食品科學與工程學院，北京 100083；2.河南科技學院食品學院，河南 新鄉 453003)

白蘿卜提取物對大鼠非酒精性脂肪肝的藥效作用

由 宏1，郝 睿1，趙功玲2，朱本忠1，朱 毅1,*，羅云波1

(1.中國農業大學食品科學與工程學院，北京 100083；2.河南科技學院食品學院，河南 新鄉 453003)

研究白蘿卜提取物對大鼠非酒精性脂肪肝病的影響。實驗用白蘿卜提取物采用旋轉蒸發的方法制備，使用脂肪乳劑灌胃法進行造模，設置低、中、高3個劑量處理組，分別以0.3、1、3mL/kg的劑量對SD大鼠進行灌胃。實驗8周后觀察各組大鼠的肝部組織病理學特點，并對血清中的脂類以及脂質過氧化相關酶類進行檢測。結果顯示：與模型組相比，雄性高劑量處理組大鼠血清甘油三酯(TG)以及丙二醛(MDA)水平明顯降低，而還原性谷胱甘肽(GSH)明顯增高。此外，肝臟病理切片顯示白蘿卜提取物有助于緩解脂肪在雄性大鼠肝中的積聚，而雌性大鼠的相關指標并無顯著性差異。因此，白蘿卜提取物可降低雄性非酒精性脂肪肝大鼠體內的脂質過氧化程度，從而起到延緩其非酒精性脂肪肝發展的作用。

非酒精性脂肪肝；白蘿卜提取物；病理學診斷

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種無過量飲酒史的以肝實質細胞脂肪變性和脂肪儲積為特征的臨床病理綜合征，肝臟組織學活檢表現為肝細胞脂肪儲積、小葉內炎癥伴氣球樣變、纖維化或Mallory透明小體[1]。包括單純性脂肪肝(liver steato)、脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis， NASH)和脂肪性肝硬化3個階段[2]。形成NAFLD的原因有很多，這其中主要包括日常膳食的營養、使用藥物的情況、家族基因遺傳情況等。目前對實驗動物的非酒精性脂肪肝造模方法主要分為基因缺陷型造模法(如使用瘦素受體缺陷性db/db小鼠作為實驗動物)[3]，營養缺陷型造模法(如使用無蛋氨酸和膽堿的飼料喂養實驗動物)[4-5]或營養過剩型造模法(如使用高脂飼料喂養實驗動物)[6-8]等。由于更加貼近人類患者的發病過程，營養過剩型造模法被更廣泛的使用。

白蘿卜(Raphanus sativus L.)既是人們喜食的蔬菜又是我國中醫治療常用的藥物，其性味辛甘而涼；入肺、胃兩經；具有消除積滯、清熱化痰、寬中下氣之功效[9]。近年來，國內外對白蘿卜的研究逐漸增多，蔣全德等[10]通過實驗表明白蘿卜提取物能夠使大鼠胃排空加快，并且這種促進作用存在量-效關系。而脂肪類物質的加速排空可以縮短其在體內的保留時間，從而對脂肪在肝中的積聚起到緩解作用。JRS(日本白蘿卜提取物)也被證明對碳水化合物和脂類代謝都有著有益的影響[11]。此外，白蘿卜提取物中含有一種生物活性很強的芥子油苷(4-(methylthio)-3-butenyl isothiocyanate)，其已被證明有突出的抗癌、抗氧化、抗菌以及抗突變的能力[12-14]。

本實驗以SD大鼠為研究對象，通過觀察肝臟病理學切片以及各項相關生化指標，評價白蘿卜提取物對非酒精性脂肪肝病的治療與緩解作用，為開發利用白蘿卜及其提取物的藥用價值提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

體質量180～200g的健康成年Sprague-Dawley(SD)大鼠50只，雌雄各半，由北京軍事科學院動物所提供。

新鮮白蘿卜，品種為長春大根，購自北京天安農業有限公司。

造模用脂肪乳配方參考Zou等[15]的制作方法，原材料均由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。配方如下：豬油400g、蔗糖150g、全脂奶粉80g、膽固醇100g、脫氧膽酸鈉10g、吐溫-80 36.4g、陶氏丙二醇31.1g、鹽10g、飲用水300g、維生素粉2.5g、礦物質粉1.5g。

甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、丙二醛(MDA)和還原型谷胱甘肽(GSH)試劑盒 南京建成生物工程有限公司；其余試劑由北京化工廠生產并提供。

RE-52旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 白蘿卜提取物的制備

36kg新鮮白蘿卜，將白蘿卜洗凈切塊后使用自制小型工業榨汁機對其破碎壓榨，壓榨過程中不斷加入水和已經榨出的白蘿卜汁，8層紗布過濾去掉沉渣后收集濾汁。將濾汁放入旋轉蒸發儀中進行濃縮后得到白蘿卜粗提物，其為黃綠色略有黏稠的液體。提取率5.72%，粗提物濃縮后1mL相當于原生藥34.8g。

1.3 動物飼養及分組

大鼠50只，雌雄各半，隨機平均分組情況如下：Ⅰ組為空白組，Ⅱ組為模型組，Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組分別為低、中、高劑量處理組(每日以0.3、1、3mL/kg劑量的白蘿卜提取物灌胃)。雌雄分開飼養。

1.4 造模方法

適應性喂養動物一周后，除空白組外，其余各組大鼠每日以10mL/kg劑量灌胃脂肪乳。每日上午一次，連續4周。普通飼料和飲用水自由攝取。低、中、高劑量處理組在脂肪乳內分別加入不同劑量的白蘿卜提取物(0.3、1、3mL/kg，以體質量計)。空白對照組、造模組和低、中劑量組以高劑量組的攝入液體體積為基準，使用同體積的生理鹽水進行灌胃處理。

1.5 標本的采集和處理

在第4周最后一次給藥后，對實驗大鼠禁食處理12h，使用無水乙醚對其進行麻醉，取血后脫頸椎處死。觀察外觀后迅速解剖，取出肝臟后放入4%多聚甲醛溶液中進行保存。檢測時使用石蠟包埋后切片，用HE法染色，光鏡下觀察組織病理學的變化。取出的血液于37℃水浴30min 后以4000r/min離心7min。取血清后放置于-80℃冰箱保存。血清生化指標采用試劑盒酶法檢測。

1.6 測定指標

動物血清中指標包括甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、丙二醛(MDA)和還原型谷胱甘肽(GSH)均由北京德易生物醫學技術有限公司使用商業用試劑盒進行檢測，肝臟病理學HE染色切片由北京302醫院病理科制作并拍照。

1.7 肝細胞脂肪變性程度評級

對每只大鼠肝細胞脂肪變性程度采用Yalniz等[16]的評級標準進行評價：組織病理學切片視野中未見細胞有脂肪變性的為0級；少于25%的細胞有脂肪變性情況的為1級；25%～50%的細胞有脂肪變性情況的為2級；50%～75%的細胞有脂肪變性情況的為3級；大于75%的細胞有脂肪變性情況的為4級。

1.8 數據處理方法

數據均采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)和Duncan多重比較檢驗進行分析。實驗結果以x±s表示，采用組間t檢驗，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 常規觀察

空白對照組動物皮毛光亮整潔，行動靈活，反應迅速，體形變化較為規律。造模模型動物目光較為呆滯，精神萎靡，反應遲鈍，腰圍增長很快。提取物處理組的大鼠相對模型組而言情況有所緩和。不同性別的同組大鼠特征有細微差別，雄鼠治療效果較為明顯。

2.2 肝臟及其他臟器觀察

空白對照組大鼠肝臟顏色鮮紅，表面光滑，邊緣較為銳利。造模組大鼠肝臟體積明顯增大，顏色較淺并發黃，表面無光澤，邊緣變鈍，切面有油膩感。高劑量白蘿卜提取物處理組的大鼠肝臟與空白對照組較為相似，低、中劑量白蘿卜提取物處理組的治療效果不明顯，但比造模組的情況略有好轉。

2.3 肝臟組織病理學檢測

圖1 各組雄性大鼠肝臟HE染色切片結構(×100)Fig.1 HE stained hepatic sections from different groups (×100)

病理學研究表明，雄性空白對照組大鼠的HE染色切片在光鏡下結構清晰，肝細胞排列整齊，肝細胞核結構清晰，并無明顯病變。雄性造模組大鼠的肝臟切片普遍顯示肝細胞變大、腫脹，胞漿內脂滴將肝細胞核擠到邊緣，病變以中央靜脈周圍最為明顯并以其為中心向外擴散。白蘿卜提取物處理組的雄性大鼠肝組織切片在光鏡下較造模組有著不同程度的改善，呈現較輕的肝脂肪病變，肝細胞形態大體空白，如圖1所示。雌性大鼠的肝臟病理學變化并不明顯，未在文中提供。

2.4 各組大鼠肝細胞脂肪變性程度評級

評級結果顯示，雄性大鼠的空白對照組中平均肝細胞脂肪變性等級為0。造模組為1.60±0.55，低劑量處理組為1.00±0.71，中劑量處理組為1.20±0.45，高劑量處理組為0.40±0.55。其中空白對照組和高劑量處理組等級顯著低于其他各組等級(P＜0.05)。雌性大鼠的評級結果均無顯著性差異。

2.5 各組大鼠血清TC、TG和HDL-C水平比較

如表1所示，造模組與空白對照組大鼠相比較，雄性組的血清TC、TG水平都有一定增加，而HDL-C水平有一定程度的降低，但均無顯著性差異。與造模組相比，高劑量處理組的雄性大鼠血清中TG水平顯著降低(P＜0.05)，而低、中劑量組的降低效果并不明顯。而雌性造模組大鼠的HDL-C水平相對空白對照組顯著降低，而雌性高劑量處理組的HDL-C水平與空白對照組相比無顯著性差異。

2.6 各組大鼠血清AST、ALT和AST/ALT的水平比較

如表2所示，造模組雄性大鼠與空白對照組相比較，AST/ALT值顯著降低(P＜0.05)，而低、中劑量處理組與空白對照組相比較則無顯著性差異。高劑量處理組的AST/ALT值比所有其他組都有顯著性增高(P＜0.05)。對雌性大鼠的研究表明，雖然低、高劑量處理組的AST/ALT值都比造模組有一定的增高，但差異并無顯著性。

表1 白蘿卜提取物對各組大鼠血清TG、TC和HDL-C值的影響(n=5)Table 1 Effect of white radish extract at different doses on serum TG, TC and HDL in SD rats (n=5)

表2 白蘿卜提取物對各組大鼠血清AST、ALT和AST/ALT值的影響(n=5)Table 2 Effect of white radish extract at different doses on serum AST, ALT and AST/ALT in SD rats (n=5)

2.7 各組大鼠血清MDA和GSH水平比較

圖2 各組大鼠血清丙二醛的水平比較(n=5)Fig.2 The serum MDA levels in rats from different experimental groups (n=5)

圖3 各組大鼠血清還原型谷胱甘肽的水平比較(n=5)Fig.3 The serum GSH levels in rats from different experimental groups (n=5)

如圖2、3所示，本實驗中雄性造模組大鼠血清中的MDA含量較空白對照組有一定的增高，而GSH含量水平則有顯著性的降低，白蘿卜提取物對這兩種脂質過氧化相關指標的影響非常明顯。相對于疾病造模組，處理組雄性大鼠的血清MDA水平顯著性降低(P＜0.05)，而低、高劑量組的GSH水平顯著性增高(P＜0.05)。

3 討 論

本實驗通過強飼法使SD大鼠攝入脂肪乳劑4周，成功地在實驗動物體內模擬出了非酒精性脂肪肝的基本癥狀。但由各組大鼠肝細胞脂肪變性程度評級結果可以看出造模組大鼠的評級并未達到文獻中提及的高度[16]。此外，病理學切片并未顯示實驗動物肝部出現纖維化以及嚴重功能性損傷。因此可以判斷本實驗中的造模組動物僅患有肝部單純性脂肪病變，處于非酒精性脂肪肝第一階段。

通過解剖后對臟器的觀察，肝細胞脂肪變性程度評級以及病理學切片可以得出每日定量攝入的白蘿卜提取物(3mL/kg)對高脂飼料誘導的雄性實驗大鼠肝部脂肪過度聚集、肝細胞脂肪變性都有較為明顯的改善作用。

對各組大鼠的血脂狀況研究表明，高劑量的白蘿卜提取物顯示出了較強的降低雄性大鼠血清中TG的能力。同時，高劑量白蘿卜提取物的處理對于緩解雌性大鼠由高脂飼料所誘導的高密度脂蛋白水平降低有著一定的效果。這表明高劑量的白蘿卜提取物對于大鼠的血脂代謝異常有著一定的藥效。

血清中的氨基轉移酶水平的變化是衡量肝功能的重要指標，AST/ALT值是近年來被廣為承認的一個評價脂肪肝發病嚴重情況的數據[17-18]，AST/ALT值越大證明肝臟越健康。對實驗動物的氨基轉移酶水平的檢測結果表明，白蘿卜提取物對雄性大鼠的肝部有較為顯著的保護作用，對雌性則并無顯著影響。此外，在本實驗中高劑量處理組的雄性大鼠的AST/ALT值顯著高于空白組(P＜0.05)，而是否過高的AST/ALT值代表一些負面的影響還有待于進一步的研究。

MDA是體內脂質過氧化的最終產物，血清內MDA的大量增加證明機體內脂質過氧化反應的增多，非酒精性脂肪肝的發病原因之一就是肝臟聚集的自由基過多。而過量的自由基引導的過氧化反應可以破壞細胞膜的完整性從而導致肝細胞的破壞。GSH是機體合成的抗氧化劑和自由基清除劑，由其制成的藥物阿拓莫蘭是治療非酒精性脂肪肝的重要輔助藥物。對于雌性大鼠而言，白蘿卜提取物對其血清MDA的含量水平同樣有顯著性的治療效果，各組間雌性大鼠的GSH值雖表現出一定規律，但并未顯示顯著性差異。本實驗中白蘿卜提取物可以有效抑制雌雄兩種性別大鼠體內由于攝入高脂食品帶來的MDA大量增加。而其保護GSH不被破壞并刺激GSH生成的能力則主要在雄性大鼠體內體現。總體而言，相對于雄性大鼠，雌性大鼠的實驗結果大多在組間沒有顯著性差異，這有可能表明雌性大鼠的肝脂代謝系統對外界的各種脅迫抗性都較雄性的更大。

萊菔(白蘿卜)做為傳統中藥一直以整體進行應用，因此本實驗中白蘿卜提取物的成分并未被單獨研究。但因為本實驗證明白蘿卜提取物對機體的抗氧化系統有很強的保護作用，所以可推斷其主要成分可能是由天然強抗氧化劑異硫氰酸鹽(isothiocyanate)[19]以及多酚、黃酮、抗壞血酸和過氧化物酶等有較強的抗氧化能力的物質組成[20]。

4 結 論

本動物實驗證明高劑量(3mL/kg，相當于生藥104g)白蘿卜提取物對非酒精性脂肪肝的發展有較強的抑制作用，其原因可能來自于白蘿卜提取物較強的抗脂質過氧化能力以及降低血液中甘油三酯積聚的能力。此外，本實驗表明性別與脂肪肝的發病與治療效果有一定的關系，而對這方面的深入認識還有待于進一步的研究。

[1] ALLARD J P, AGHDASSI E, MOHAMMED S, et al. Nutritional assessment and hepatic fatty acid composition in non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD): a cross-sectional study[J]. Journal of Hepatology, 2008, 48(2): 300-307.

[2] FARRELL G C, LARTER C Z. Nonalcoholic fatty liver disease: from steatosis to cirrhosis[J]. Hepatology, 2006, 43(2 Suppl 1): 99-112.

[3] NAGAO K, INOUE N, INAFUKU M, et al. Mukitake mushroom (Panellus serotinus) alleviates nonalcoholic fatty liver disease through the suppression of monocyte chemoattractant protein 1 production in db/ db mice[J]. Journal of Nutritional Biochemistry, 2010, 21(5): 418-423.

[4] USTUNDAG B, BAHCECIOGLU I H, SAHIN K, et al. Protective effect of soy isoflavones and activity levels of plasma paraoxonase and arylesterase in the experimental nonalcoholic steatohepatitis model[J]. Digestive Diseases and Sciences, 2007, 52(8): 2006-2014.

[5] LARTER C Z, YEH M M, HAIGH W G, et al. Hepatic free fatty acids accumulate in experimental steatohepatitis: role of adaptive pathways[J]. Journal of Hepatology, 2008, 48(4): 638-647.

[6] LIEBER C S, LEO M A, MAK K M, et al. Model of nonalcoholic steatohepatitis[J]. American Journal of Clinical Nutrition, 2004, 79(3): 502-509.

[7] BAUMGARDNER J N, SHANKAR K, HENNINGS L, et al. A new model for nonalcoholic steatohepatitis in the rat utilizing total enteral nutrition to overfeed a high-polyunsaturated fat diet[J]. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology, 2007, 294(1): G27-G28.

[8] DENG Qinggao, SHE Hongyun, CHENG J H, et al. Steatohepatitis induced by intragastric overfeeding in mice[J]. Hepatology, 2005, 42(4): 905-914.

[9] 蔣全德, 王景杰, 黃裕新. 白蘿卜及其提取物對胃腸動力作用的研究現狀及展望[J]. 胃腸病學和肝病學雜志, 2006(3): 312-317.

[10] 蔣全德, 王景杰, 劉琳娜, 等. 白蘿卜提取物對大鼠胃腸動力影響的實驗研究[J]. 胃腸病學和肝病學雜志, 2006(3): 292-294.

[11] TANIGUCHI H, KOBAYASHI-HATTORI K, TENMYO C, et al. Effect of Japanese radish (Raphanus sativus) sprout (Kaiware-daikon) on carbohydrate and lipid metabolisms in normal and streptozotocin-induced diabetic rats[J]. Phytotherapy Research, 2006, 20(4): 274-278.

[12] BEEVI S S, MANGAMOORI L N, DHAND V, et al. Isothiocyanate profile and selective antibacterial activity of root, stem, and leaf extracts derived from Raphanus sativus L.[J]. Foodborne Pathogens and Disease, 2009, 6(1): 129-136.

[13] SHISHU, KAUR I P. Inhibition of cooked food-induced mutagenesis by dietary constituents: comparison of two natural isothiocyanates[J]. Food Chemistry, 2009, 112(4): 977-981.

[14] BEN SALAH-ABBES J, ABBES S, ABDEL-WAHHAB M A, et al. Raphanus sativus extract protects against Zearalenone induced reproductive toxicity, oxidative stress and mutagenic alterations in male Balb/c mice[J]. Toxicon, 2009, 53(5): 525-533.

[15] ZOU Yuhong, LI Jun, LU Chao, et al. High-fat emulsion-induced rat model of nonalcoholic steatohepatitis[J]. Life Sciences, 2006, 79(11): 1100-1107.

[16] YALNIZ M, BAH ECIOGLU I H, KUZU N, et al. Amelioration of steatohepatitis with pentoxifylline in a novel nonalcoholic steatohepatitis model induced by high-fat diet[J]. Digestive Diseases and Sciences, 2007, 52(9): 2380-2386.

[17] AHMED U, REDGRAVE T G, OATES P S. Effect of dietary fat to produce non-alcoholic fatty liver in the rat[J]. Journal of Gastroenterology and Hepatology, 2009, 24(8): 1463-1471.

[18] OHGO H, YOKOYAMA H, HIROSE H, et al. Significance of ALT/AST ratio for specifying subjects with metabolic syndrome in its silent stage [J]. Diabetes and Metabolic Syndrome: Clinical Research and Reviews, 2009, 3(1): 3-6.

[19] NAKAMURA Y, IWAHASHI T, TANAKA A, et al. 4-(Methylthio)-3-butenyl isothiocyanate, a principal antimutagen in daikon (Raphanus sativus; Japanese white radish)[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49(12): 5755-5760.

[20] WANG Linsong, WEI Liqin, WANG Lin, et al. Effects of peroxidase on hyperlipidemia in mice[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50(4): 868-870.

Effect of White Radish Extract on Nonalcoholic Fatty Liver Diseases in SD Rats

YOU Hong1，HAO Rui1，ZHAO Gong-ling2，ZHU Ben-zhong1，ZHU Yi1,*，LUO Yun-bo1
(1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China；2. School of Food Science, Henan Institute of Technology, Xinxiang 453003, China)

In order to exploit the medicinal value of white radish, the effect of white radish extract on the amelioration of nonalcoholic fatty liver diseases in SD rats was explored. The white radish extract was prepared with a rotary evaporator. The rats in model group were treated with fat emulsion with white radish extract by gavage at the doses of 0.3, 1 mL/kg and 3 mL/kg. The pathological characteristics of liver tissues in rats with 8 weeks experiments were analyzed. Meanwhile, serum lipid and lipid peroxidases were determined. The results indicated that white radish extract at a high dose could significantly decrease the levels of serum TG and MDA and increase the levels of GSH in male rats. Moreover, white radish extract could alleviate the accumulation of lipid in the hepatocytes of male rats. However, no obvious change of these parameters in female rats was observed. Therefore, white radish extract can ameliorate nonalcoholic fatty liver diseases in SD male rats by decreasing the level of lipid peroxidation.

nonalcoholic fatty liver disease；white radish extract；pathological diagnosis

R151.3

A

1002-6630(2011)07-0300-05

2010-09-06

中央高校基本科研業務費專項資金項目(2009-1-86)

由宏(1986—)，男，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：a_you_hong@163.com

*通信作者：朱毅(1973—)，女，副教授，博士，研究方向為食品科學。E-mail：zhuyi_cau@126.com