當歸多糖磁性超濾膜分級分離

謝慧明，朱瑩瑩，張仕發，伍志剛

(合肥工業大學 農產品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009)

當歸多糖磁性超濾膜分級分離

謝慧明，朱瑩瑩*，張仕發，伍志剛

(合肥工業大學 農產品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009)

基膜為80000的聚砜超濾膜經原位生成法制備得磁性超濾膜。在壓力為0.2MPa條件下改變磁場強度，其截留相對分子質量可調控范圍為31000～73000。利用此膜對純度為97.5%的當歸多糖進行連續分級分離，在不同磁場強度下得到3個樣品(A、B和C)。高效凝膠色譜法測定樣品A、B以及C的重均相對分子質量分別為86317、19989、62461，樣品A中相對分子質量為70000～100000的當歸多糖占70%左右；樣品B中相對分子質量為10000～30000的當歸多糖占95%左右；樣品C中相對分子質量為50000～70000的當歸多糖占80%左右。

當歸多糖；磁性超濾膜；高效凝膠液相色譜；連續分離

當歸多糖具有很強的生物活性，現代藥理學研究證明當歸多糖可以提高免疫力[1]、去除自由基[2]、激活補體活性等功效[3]、還具有鎮痛[4]、保護胃腸黏膜[5]的作用，另外對抗腫瘤[6]、抗輻射損傷[7]也均呈現較好療效。當歸多糖的相對分子質量分布廣泛，其生物活性與其相對分子質量范圍密切相關的，多糖相對分子質量太大或太小均會影響其活性，其中抗補體活性高，免疫活性強的當歸多糖其相對分子質量多在10000～30000之間[8-10]，能保護細胞，促進細胞增殖反應的當歸多糖其相對分子質量多在50000～70000之間[11-12]，而具有抑制腫瘤作用的當歸多糖相對分子質量一般在70000以上[13-14]。目前按相對分子質量分離當歸多糖的方法主要有超濾法和凝膠柱層析法，其中超濾法[15-16]采用的均是截留相對分子質量不變的膜，不能實現當歸多糖的連續分級分離。本實驗擬采用實驗室自制的磁性超濾膜，通過改變磁場強度，實現相對分子質量在10000～100000之間的當歸多糖的連續分級分離。根據不同相對分子質量多糖具有不同的側重功效，目標多糖分為3段不同相對分子質量范圍：10000～30000、50000～70000、70000～100000。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

當歸產于甘肅岷縣；葡萄糖(AR) 國藥集團化學試劑有限公司；苯酚(重蒸餾；AR)、無水乙醇(AR) 上海中試化工總公司；聚砜超濾膜 安得膜分離技術工程有限公司；右旋糖酐對照品(Mw分別為200000、133800、84400、41100、21400、7100、4600) 中國藥品生物制品鑒定所；FeCl2·4H2O(AR) 天津太茂化學試劑廠；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

分析天平 美國西特公司；多功能膜分離設備 自制；UV-1600紫外分光光度計 北京奧生源科技有限責任公司；1100型高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司；Shodex OHPak SB-804HQ凝膠色譜柱 上海安譜科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 當歸多糖的制備

提取工藝：①當歸粉碎，3倍量(mL/g)乙醇浸泡24h，收集濾渣，烘干備用；②水法浸提當歸多糖工藝條件：料液比1∶10(g/mL)，浸提溫度90℃，浸提時間3h，浸提2次；③過濾，離心，收集濾液減壓濃縮，濃縮液經無水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌，得當歸多糖粗提物備用。

超濾純化：當歸多糖粗提物溶于水中配成溶液，選擇截留相對分子質量為10000的聚砜超濾膜對其進行超濾分離，得到的截留液再用截留相對分子質量為100000的聚砜超濾膜進行超濾分離，收集透過液，得到相對分子質量在10000～100000當歸多糖溶液，凍干備用。

1.3.2 磁性超濾膜的制備與檢測

圖1 Fe3O4-PSF磁性復合超濾膜制備示意圖Fig.1 Schematic diagram of the device for the preparation of Fe3O4-PSF magnetic ultrafiltration membrane

原位生成法制備磁性復合膜[17]：分別選用截留相對分子質量為70000、80000、90000的聚砜超濾膜作為磁性超濾膜的基體膜，無水乙醇浸泡基體膜10min后，將其置于超濾膜制備反應器中，如圖1所示。反應器兩側加入的溶液分別為2mol/L NaOH溶液和0.2mol/L FeCl2乙醇溶液，反應45min后將復合膜取出，洗滌、晾干，分別記為膜1、2、3，保存備用。

截留相對分子質量的檢測：采用葡聚糖檢測其截留相對分子質量。由于壓力過小，自制的磁性超濾膜通量小，過濾的速度比較慢；而壓力過大，自制的磁性超濾膜會存在破裂現象，因此選擇工作壓力0.2MPa。實驗裝置示意圖見圖2，分別將不同相對分子質量的葡聚糖加入料液瓶中，在磁場強度0T、壓力0.2MPa條件下，待流量穩定后收集一定量的截留液和透過液，紫外分光光度計檢測其濃度，計算截留率R，規定R≥90%的截留基準物相對分子質量為膜的截留相對分子質量。

式中：R為截留率/%；C透為透過液濃度/(mol/L)；C原為原料液濃度/(mol/L)。

圖2 磁場超濾裝置示意圖Fig.2 Schematic diagram of magnetic ultrafiltration device

1.3.3 磁性超濾膜截留相對分子質量可調控范圍的測定

在0.2MPa條件下，0.2～1.0T間調節磁場強度，以葡聚糖為基準物，測出不同磁場強度下對不同相對分子質量葡聚糖的截留率，得出磁性超濾膜截留相對分子質量的可調控范圍。

1.3.4 當歸多糖分級分離

根據3張磁性超濾膜截留相對分子質量的調控范圍，選取最合適分離目標當歸多糖的膜，調節適宜的磁場強度，收集透過液或截留液，凍干稱量，高效凝膠液相色譜分析其相對分子質量范圍。

1.3.5 相對分子質量的測定

色譜條件：參照文獻[18]的方法。色譜柱：Shodx OHPaK SB-804HQ；流動相 0.71%硫酸鈉溶液(內含0.02%疊氮化鈉)；柱溫35℃；流速為0.5mL/min；示差折光檢測器。

對照品溶液：精確稱取右旋糖酐對照品，流動相配成3mg/mL的溶液，用0.45μm的微孔濾膜過濾。

供試品溶液：精確稱取超濾后凍干的當歸多糖，流動相配成3mg/mL的溶液，用0.45μm的微孔濾膜過濾。

標準曲線的制備：取重均分子質量為200000、84400、41100、21400、10000、4600D的右旋糖苷對照品溶液分別進樣測定，記錄峰值保留時間，GPC軟件繪制標準曲線。

樣品相對分子質量的測定：取供試品溶液進樣測定，記錄色譜圖，根據峰值保留時間，GPC軟件計算樣品的重均相對分子質量和數均相對分子質量以及相對分子質量分布寬度。

2 結果與分析

2.1 當歸多糖的制備結果

稱取當歸多糖粗提物50g，配成10g/L的溶液，選擇截留相對分子質量為10000的聚砜超濾膜進行超濾分離，得到的截留液再用截留相對分子質量為100000的聚砜超濾膜進行超濾分離，收集透過液，得到相對分子質量在10000～100000當歸多糖溶液，凍干得當歸多糖10.22g，苯酚-H2SO4法測得其純度為97.5%。

2.2 磁性超濾膜的檢測結果

2.2.1 膜截留相對分子質量的測定結果

圖3 無外加磁場下膜截留相對分子質量的測定Fig.3 Determination of MWCO of the prepared magnetic composite membrane without additional magnetic field

由圖3可知，膜1、2、3截留率(R)為90%對應的基準物相對分子質量分別為65000、73000、83000。表明在超濾壓力0.2MPa、無外加磁場的條件下，用截留相對分子質量為70000、80000、90000的基體膜制備的磁性復合超濾的截留相對分子質量分別為65000、73000、83000。磁性膜的截留相對分子質量相對基膜減小，是由于采用原位生成法制備磁性膜時，生成的納米Fe3O4粒子絕大多數沉積在膜孔道中，致使膜孔變小，膜截留相對分子質量降低。

2.2.2 磁性超濾膜截留相對分子質量可調控范圍的測定

由圖4可知，0.2MPa條件下，在0.2～1.0T的范圍內改變磁場強度，磁性超濾膜1～3的截留相對分子質量調控范圍分別為25000～51000、31000～63000、42000～ 74000。其中不同磁場強度下，膜的截留相對分子質量如表1所示。

圖4 磁性超濾膜截留相對分子質量可調控范圍的測定Fig.4 Determination of MWCO range of the prepared magnetic composite membrane

表1 磁性超濾膜截留相對分子質量可調控范圍的測定Table 1 MWCO range of the prepared magnetic composite membrane under different magnetic field intensities

根據上述測定結果以及目標多糖的3段不同相對分子質量范圍：10000～30000、50000～70000、70000～100000，選用膜2進行以后實驗較為適宜。

2.3 當歸多糖分級分離結果

2.3.1 超濾分級分離

稱取凍干后的當歸多糖10.0g，配成5g/L的溶液，加入到料液瓶中，在0T、0.2MPa條件下收集截留液得樣品A；再將透過液加入料液瓶中，保持壓力不變，調節磁場強度至1.0T收集透過液得樣品B；最后調節磁場強度至0.6T收集截留液得樣品C，凍干得到樣品A 3.97g、樣品B 2.86g、樣品C 1.98g。

2.3.2 相對分子質量的測定

2.3.2.1 標準曲線的制作

以標準品的重均相對分子質量MW的對數值為縱坐標，保留時間tR為橫坐標，用GPC軟件得到標準回歸曲線lg(MW)=7.319-0.253tR(r=-0.9931)。

2.3.2.2 樣品相對分子質量的測定

高效凝膠色譜法分別測定其重均相對分子質量、數均相對分子質量和相對分子質量分布如表2所示。相對分子質量累積分布曲線如圖5所示。

表2 樣品的重均相對分子質量、數均相對分子質量和相對分子質量分布寬度測定結果Table 2 Mw, Mn and Mw/Mn of fractions A, B and C

樣品A中，重均相對分子質量為86317，數均相對分子質量為40375，相對分子質量分布寬度為2.14，相對分子質量在70000～100000的當歸多糖占70%左右；樣品B中，重均相對分子質量為19989，數均相對分子質量為10359，相對分子質量分布寬度為1.93，相對分子質量在10000～30000的當歸多糖占95%左右；樣品C中，重均相對分子質量為62461，數均相對分子質量為31267，相對分子質量分布寬度為2.00，相對分子質量在50000～70000的當歸多糖占80%左右。

由此得出，在壓力0.2MPa條件下，通過改變磁場強度，實現了一張膜對不同相對分子質量當歸多糖的連續分級分離。

圖5 樣品A、B、C相對分子質量累積分布曲線Fig.5 Cumulative weight distribution curve of molecular weight for fractions A, B and C

3 結 論

水法浸提得到的當歸多糖粗提物，經截留相對分子質量為10000和100000的聚砜超濾膜純化后，得純度為97.5%的白色當歸多糖。

采用原位生成法，以截留相對分子質量為80000的聚砜超濾膜作為基膜制備得到磁性超濾膜。以葡聚糖為基準物，測定此膜在0.2MPa、0.0～1.0T條件下的截留相對分子質量可調控范圍為31000～73000。

用此磁性超濾膜對純化后當歸多糖進行分級分離，不同磁場強度下收集截留液或透過液，凍干得到3個樣品，高效凝膠色譜對樣品進行測定。其中A樣品質量3.97g、Mw為86317、相對分子質量在70000～100000的當歸多糖占70%左右；B樣品質量2.86g、Mw為19989、相對分子質量在10000～30000的當歸多糖占95%左右；C樣品質量1.98g、Mw為62461、相對分子質量在50000～70000的當歸多糖占80%左右。

[1]楊鐵虹, 盧保華, 賈敏, 等. 當歸多糖對小鼠免疫功能的影響[J]. 中國藥理學通報, 2003, 31(4)∶ 37-40.

[2]YANG Xingbin, ZHAO Yan, ZHAO Youlv. In vivo macrophage activation and physicochemical property of the different polysaccharide fractions purified from Angelica sinensis[J]. Carbohydrate Polymers, 2008, 71(3)∶ 372-379.

[3]ZHANG Yongwen, KIYOHARA H, SAKURAI M H, et al. Complement activation galactan chains in a pectic arabinogalactan from the roots of Angelica acutiloba Kitagawa[J]. Carbohydrate Polymer, 1996, 31(3)∶149-156.

[4]樂江, 彭仁, 孔銳, 等. 當歸粗多糖鎮痛作用的實驗研究[J]. 中國藥學雜志, 2002, 37(10)∶ 746-748.

[5]HUI M K C, WU W K K, SHIN V Y, et al. Polysaccharides from the root of Angelica sinensis protect bone marrow and gastrointestinal tissues against the cytotoxicity of cyclophosphamide in mice[J]. International Journal of Medical Sciences, 2006, 3(1)∶ 1-6.

[6]商澎, 楊鐵虹, 賈敏, 等. 當歸多糖AP-0對小鼠移植性腫瘤的抑制作用[J], 第三軍醫大學學報, 2001, 23(11)∶ 1299-1302.

[7]洪艷, 劉君炎, 王紅玲, 等. 當歸多糖對放射損傷小鼠細胞免疫的調節作用[J]. 武漢大學學報∶ 醫學版, 2001, 21(4)∶ 305-306.

[8]王曉娟, 魏傳晚, 徐淑永, 等. 生物活性多糖結構與功效關系的研究進展[J]. 廣州化工, 2004, 32(1)∶ 6-10.

[9]洪艷, 劉君炎. 當歸多糖對加60Co照射小鼠免疫功能影響的研究[J].華中醫學雜志, 2000, 24(6)∶ 291-292

[10]單俊杰, 王易. 當歸多糖對小鼠脾淋巴細胞增殖及誘生IFN-γ的影響[J]. 藥學學報, 2002, 37(7)∶ 497-500.

[11]楊鐵紅, 賈敏, 梅其炳. 當歸多糖組分促進淋巴細胞增殖及對IL-2和IFN-γ的誘生作用[J]. 中藥材, 2008, 28(5)∶ 405-407.

[12]楊鐵紅, 賈敏, 梅其炳, 等. 當歸多糖組分AP-3對不同淋巴細胞亞群的作用[J]. 中國生化藥學雜志, 2005, 26(6)∶ 344-346.

[13]曹蔚, 李小強, 侯穎, 等. 當歸多糖APS-2a的結構分析及抗腫瘤作用研究[J]. 中藥材, 2008, 31(2)∶ 261-266.

[14]林玉露. 多糖的化學結構及構效關系研究[J]. 武漢教育學院學報, 2000,19(6)∶ 34-37.

[15]樊秦, 李應東, 趙文君, 等. 超濾膜純化當歸多糖的研究[J]. 中國中醫藥信息雜志, 2009, 16(8)∶ 54-55.

[16]劉新友, 周四元, 程建峰, 等. 超濾對當歸多糖組分總糖含量和蛋白含量的影響[J]. 時珍國醫國藥, 2007, 18(12)∶ 2895-2897.

[17]潘見, 晉明會, 趙金龍, 等. Fe3O4/PSF磁性復合超濾膜的制備、表征及應用[J]. 膜科學與技術, 2009, 29(5)∶ 39-43.

[18]國家藥典委員會. 中國藥典∶ 二部 [M]. 北京∶ 化學工業出版社, 2005∶附錄VH.

Use of a Magnetic Ultrafiltration Membrane for the Separation of Angelica sinensis Root Polysaccharides

XIE Hui-ming，ZHU Ying-ying*，ZHANG Shi-fa，WU Zhi-gang
(Engineering Research Center of Bio-Process, Ministry of Education, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

A magnetic ultrafiltration membrane whose molecular weight cut-off (MWCO) can be between 31000 and 73000 under 0.2 MPa pressure and varying magnetic field intensity was prepared by in situ synthesis on the basis of a polysulfone ultrafiltration membrane with a MWCO of 80000 and used sequentially separate Angelica sinensis root polysaccharides with a purity of 97.5%. As a result, three fractions were obtained under various magnetic filed intensities and named as A, B and C, respectively. Their respective weight average molecular weights (Mw) were determined by high performance gel permeation chromatography (HPGPC) to be 86317, 19989 and 62461. Polysaccharides with a relative molecular weight ranging from 70000 to 100000 was 70% in fraction A. Roughly 95% of fraction B consisted of polysaccharides with a relative molecular weight between 10000 and 30000. Fraction C contained approximately 80% of polysaccharides whose molecular weight was in the range of 50000-70000.

polysaccharides from the root of Angelica sinensis；magnetic ultrafiltration membrane；high performance gel permeation chromatography (HPGPC)；continuous separation

TQ315

A

1002-6630(2011)14-0011-05

2010-07-26

國家“863”計劃項目(2007AA100404)

謝慧明(1955—)，女，教授，博士，研究方向為農產品加工及貯藏。E-mail：xiehuiming-6@163.com

*通信作者：朱瑩瑩(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為糧食、油脂及蛋白質工程加工。E-mail：zhuyingying0914@gmail.com