響應面法優化中性蛋白酶提取牡蠣牛磺酸酶解工藝條件

劉亞南，張志勝，佟海菊，孫克巖，宋 欣

(河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071001)

響應面法優化中性蛋白酶提取牡蠣牛磺酸酶解工藝條件

劉亞南，張志勝*，佟海菊，孫克巖，宋 欣

(河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071001)

利用中性蛋白酶對牡蠣進行酶解，在單因素試驗基礎上，研究加酶量、pH值、溫度3個因素對酶解過程中牛磺酸提取量的影響，通過三因素三水平Box-Behnken響應面分析法優化其酶解工藝。結果顯示：在加酶量1300U/g、pH7.5、溫度48℃條件下，牛磺酸提取量實際值可達2.724mg/g。

牡蠣；牛磺酸；響應面法；酶解

牛磺酸是人和動物重要的營養物質，具有消炎解毒、保肝利膽、降血脂、促進幼兒大腦發育及安神健腦等重要的生理活性[1-5]。國內外對牛磺酸的制取主要有兩種，一是化學合成，二是從天然產物中提取。化學合成的生產量雖然高，但成本高、污染嚴重，而且生物活性與天然牛磺酸比較低，因此從天然產物中提取牛磺酸具有廣闊的前景。牛磺酸廣泛存在于除植物外的許多生物體的組織間液或細胞內液中，并以小分子的二肽或三肽的形式存在于中樞神經系，但不參與蛋白質的合成[6]。在水產品中含量最為豐富，如青花魚、墨魚、章魚、牡蠣、蛤蜊、蝦等，而牡蠣、蛤蜊等海洋生物中牛磺酸提取量較高，據文獻報道每千克鮮牡蠣中約含有4～8g的牛磺酸[6-7]。

目前，海洋生物中牛磺酸的提取多采用水煮法，利用溶出的氨基酸量或水解度來衡量牛磺酸的提取效果。但時間過短牛磺酸溶出不徹底，時間過長又會使細胞內雜質大量溶出[8]。考慮到后續分離純化，而采用較溫和的酶解法，既減少雜質的溶出，又提高了牛磺酸的溶出量。本實驗利用中性蛋白酶對牡蠣進行酶解，以牛磺酸提取量為指標，結合響應面分析對酶解工藝進行優化，得到牛磺酸提取的適宜條件。

1 材料與方法

1.1 原料

牡蠣 唐山豐瑞水產食品有限公司；枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(以下稱中性蛋白酶，實際酶活80000U/g) 索來寶科技有限公司；牛磺酸標準樣(純度≥99%) 上海藍季科技發展有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV2800H紫外分光光度計 尤尼科(上海)儀器有限公司；HH-4電熱恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司；DELTA320精密pH計 上海精密科學儀器有限公司；79-1磁力攪拌器 金壇市醫療儀器廠；JJ-2組織搗碎均漿機 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；GL2G2Ⅱ立式冷凍離心機 上海安亭科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛磺酸酶解提取工藝[9-10]

將牡蠣肉清洗勻漿，稱取一定量按照試驗設計方案確定的試驗參數調整料液比、pH值、溫度、酶解時間等，將勻漿液在水浴鍋中按試驗設計溫度預熱15min，然后按照試驗設計方案添加蛋白酶進行恒溫酶解，期間每10min用玻璃棒攪拌一次，酶解完成后樣品在沸水浴中滅酶10min，冷卻，6000r/min離心15min后取上清液，測定牛磺酸提取量，實驗平行3次。

1.3.2 牛磺酸提取量的測定

1.3.2.1 檢測方法[11]

在醋酸鈉的作用下，牛磺酸與乙酰丙酮和甲醛加熱反應生成黃色配合物，其吸光度與牛磺酸濃度在一定范圍內呈正比。顯色劑：10mL NaAc(1mol/L)、0.6mL乙酰丙酮、0.4mL甲醛用水定容至25mL。測定時精密量取1mL樣品，加入1.5mL顯色劑和2.5mL水，用棉塞封住口，100℃水浴15min，冷卻后在400nm波長處測定牛磺酸提取量。

1.3.2.2 標準曲線方程的得出

配制不同濃度的牛磺酸標準溶液，在400nm波長處進行測定吸光度。每次測定所用提取液，用蒸餾水定容至50mL，從中吸取1mL進行測定，按標準曲線進行計算。回歸方程為y=2.0207χ＋0.0054，R2=0.9993，式中，y為吸光度、χ為牛磺酸提取量/(mg/g)。

1.3.3 中性蛋白酶酶解工藝參數的優化[12-14]

在單因素試驗的基礎上，根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，結合單因素試驗結果，以加酶量(X1)、pH值(X2)和溫度(X3)為變量因素，每一個自變量的低、中、高實驗水平分別以-1、0、1進行編碼，試驗設計見表1。

表1 響應面分析因素水平Table 1 Variables and their coded levels in the response surface design

2 結果與分析

2.1 酶解工藝回歸模型的建立

根據表1進行響應面試驗，測定每個因素水平時牛磺酸的提取量，結果如表2所示。

表2 牛磺酸提取工藝Box-Behnken試驗設計與結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

利用Design Expert軟件，對表2數據進行二次回歸擬合，得到回歸方程Y=2.78+0.38X1+0.33X2+0.15X3-0.078X1X2+0.065X1X3+0.072X2X3-0.39-0.36-0.26。

2.2 回歸模型的檢驗

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

通過Design Expert對表2數據進行方差分析，結果見表3。模型的P值為0.0008(＜0.01)，說明該模型在概率為0.01水平上能夠擬合試驗數據，回歸模型極顯著。模型中加酶量(X1)、pH值(X2)、、對牛磺酸提取量的影響極顯著，X3(溫度)、對牛磺酸提取量的影響顯著。該模型回歸顯著(P＜0.01)、失擬項不顯著(P=0.1561＞0.05)，并且該模型的R2=0.9527，0.8919，說明該模型與實際實驗擬合較好，自變量與響應值之間線性關系顯著，可以用于牛磺酸提取的實驗預測。

2.3 酶解工藝參數的確定

為直觀尋找最適宜變量組合，使得響應值達到最大，采用Design Expert軟件對3因素之間的交互作用進行全面的模型分析，并繪制響應面曲線圖。響應面圖形是響應值對各試驗因子X1、X2、X3所構成的三維空間的曲面圖，從響應面分析圖上可形象地看出最佳參數及各級參數之間的相互作用。當特征值均為正值時，響應面的分析圖為山谷形曲面，有極小值存在；當特征值為負值時，響應面的分析圖形為山丘形曲面，有極大值存在；當特征值有正有負時，為馬鞍形曲面，無極值存在。等高線圖可以直觀地反映兩變量交互作用的顯著程度，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形與之相反。圖1b、圖2b及圖3b中等高線均呈橢圓形，表明各圖中兩因素交互作用顯著[15]。圖1～3分別顯示了3組實驗參數以牛磺酸提取量為響應值的趨勢圖。

圖1 加酶量和pH值對牛磺酸提取量影響的響應曲面和等高線圖Fig.1 Response surface plot and contour showing the effects of enzyme dosage and pH value on taurine extraction yield

圖2 pH值和溫度對牛磺酸提取量影響的響應曲面和等高線圖Fig.2 Response surface plot and contour showing the effects of pH value and temperature on taurine extraction yield

圖3 加酶量和溫度對牛磺酸提取量影響的響應曲面和等高線圖Fig.3 Response surface plot and contour shwoing the effects of enzyme dosage and temperature on taurine extraction yield

從圖1可以看出，加酶量和pH值對牛磺酸提取量影響較大。隨著加酶量及pH值的提高，牛磺酸提取量呈先升高后下降的趨勢。加酶量到某一值時，酶與底物達到飽和，而隨著pH值的升高酶活性也在降低。因此只有在適宜的加酶量及pH值條件下，牛磺酸的含量才會達到理想值。同樣從圖2、3可以看出，只有在pH值與溫度、加酶量與溫度適宜的情況下，牛磺酸提取量才能達到最大值。

由圖1a、2a、3a可以得出，響應面存在最大值。由數據分析可得牛磺酸提取最適宜酶解工藝條件為加酶量1296U/g、pH7.53、溫度47.8℃，牛磺酸提取量的理論最大值為2.70mg/g。但考慮到實際生產的方便性，最適宜工藝條件相應修正為加酶量1300U/g、pH7.5、溫度48℃。在此修正條件下，做3個平行，測得實際提取量為2.724mg/g，與理論值相差不多，可見該模型可較好的反應牛磺酸的提取條件。與水煮法相比酶解法溶出的雜質少，而且水解液中含有豐富的氨基酸和肽類，還可以用于分離其他氨基酸或肽類等，對其進行多方面的綜合利用。

3 結 論

本實驗建立了以牛磺酸提取量為響應值，以加酶量、pH值、溫度因素的數學模型。在本實驗設計范圍內，影響牛磺酸提取量的主次順序為加酶量、pH值、溫度。方差分析表明該模型擬合行較好。最終確定出牛磺酸提取的最適宜酶解工藝條件為加酶量1300U/g、pH7.5、溫度48℃。

在最適宜條件下進行驗證實驗得到牛磺酸提取量為2.724mg/g，與理論值相差不明顯，說明該模型可以較好地反映牛磺酸提取的條件。因此，采用響應面法優化得到的提取條件參數具有可行性與應用價值。

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Employing Response Surface Methodology to Optimize Process Conditions for Enzymatic Extraction of Taurine from Oyster Meat with Neutral Protease

LIU Ya-nan，ZHANG Zhi-sheng*，TONG Hai-ju，SUN Ke-yan，SONG Xin
(College of Food Science and Technology, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China)

In this study, neutral protease hydrolysis was used to extract taurine from oyster meat and the extraction process was optimized. On the basis of one-factor-at-a-time experiments, a three-variable, three-level Box-Behnken experimental design coupled with response surface analysis was employed to explore the effects of enzyme dosage, pH and temperature on the extraction efficiency of taurine. The optimum hydrolysis conditions for taurine extraction were enzyme dosage 1300 U/g fresh meat, pH 7.5 and hydrolysis temperature 48 ℃, and the resulting extraction yield of taurine was 2.724 mg/g fresh meat.

oyster；taurine； response surface methodology；enzymolysis

TS254.4

A

1002-6630(2011)14-0025-04

2010-09-09

國家海洋公益性行業科研專項(200805046)

劉亞南(1984—)，女，碩士研究生，研究方向為農產品加工與貯藏工程。E-mail：yananliu1984@sina.cn

*通信作者：張志勝(1970—)，男，教授，博士，研究方向為農產品加工與貯藏工程。E-mail：zhangzhisheng66@139.com