響應(yīng)面法優(yōu)化豬肚菇多糖的提取工藝

楊潤亞，楊樹德，董洪新，袁如月

(魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264025)

響應(yīng)面法優(yōu)化豬肚菇多糖的提取工藝

楊潤亞，楊樹德，董洪新，袁如月

(魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264025)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化豬肚菇子實(shí)體中水溶性多糖的超聲提取工藝。結(jié)果表明，在提取溫度72℃、料液比1∶44、浸提時(shí)間57min的最佳提取工藝條件下，響應(yīng)面擬和所得方程對豬肚菇多糖的最大提取率預(yù)測值78.22mg/g，實(shí)測值75.79mg/g，實(shí)測結(jié)果與預(yù)測值符合良好。

豬肚菇；超聲提取；多糖；響應(yīng)面分析

食用菌是人類實(shí)踐活動中最早認(rèn)識和利用的一類菌物，具有種類繁多、世代短、生物量大、易培養(yǎng)、分布廣和營養(yǎng)成分豐富等特點(diǎn)。食用菌多糖具有抗病毒、抗腫瘤、抗輻射、抗?jié)儭⒖顾ダ稀⒃鰪?qiáng)免疫力、降血脂、降血糖等生理活性，是新藥和功能食品開發(fā)的重要原料，目前已成為農(nóng)學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品科學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[1-3]。

豬肚菇是國內(nèi)近年來新開發(fā)的一種珍稀食用菌，其營養(yǎng)豐富，口感風(fēng)味獨(dú)特，有豬肚般的滑膩， 因此而得商品名“豬肚菇”。菌柄去掉表皮后食用有似竹筍般的清脆，故市場上將去皮的菌柄稱為“筍菇”。在新發(fā)表的《中國食用菌名錄》中，豬肚菇學(xué)名為大革耳[Panus giganteus (Berk.) Corner]，豬肚菇的分類地位隸屬于擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)、多孔菌目(Polyporales)、多孔菌科(Polyporaceae)、革耳屬(Panus)[4]。目前，國內(nèi)外對豬肚菇的研究主要集中在營養(yǎng)價(jià)值、生物學(xué)特性及栽培技術(shù)等方面[4]，而對豬肚菇多糖方面的研究報(bào)導(dǎo)則相對較少[5-7]。

響應(yīng)面法是利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法[8-9]。隨著計(jì)算機(jī)的發(fā)展，它已被廣泛用于農(nóng)業(yè)、生物、食品、化學(xué)、制造等領(lǐng)域，進(jìn)行活性物質(zhì)提取或目標(biāo)過程的優(yōu)化[10-14]，但在豬肚菇多糖的提取工藝研究方面尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以豬肚菇子實(shí)體為材料，利用超聲波輔助提取技術(shù)提取豬肚菇多糖，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法對豬肚菇多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以確定豬肚菇多糖超聲提取的最佳工藝參數(shù)，為豬肚菇的深層開發(fā)利用提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肚菇子實(shí)體：由魯東大學(xué)食用菌研究所提供。置于烘箱里50℃烘干，粉碎后稱取80g，按照料液比為1∶30加入80%的乙醇，放入超聲波清洗器中提取1h(功率80%、溫度70℃)，之后抽濾，除去濾液，重復(fù)兩次。將濾渣置于烘箱里50℃烘干備用。

無水乙醇、蒽酮、濃硫酸、葡萄糖(均為分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

7200紫外-可見分光光度計(jì) 尤尼克(上海)儀器有限公司；DHG-9143BS-III型數(shù)顯電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；FA1604型電子天平 上海天平儀器廠；KQ-500B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；SHB-IV雙A循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；XA-1型高速萬能粉碎機(jī) 江蘇姜堰市銀河實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取葡萄糖10mg，加蒸餾水定容至100mL容量瓶中。取7支試管，分別加入上述葡萄糖溶液0.0、0.1、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5mL，并分別加蒸餾水補(bǔ)充至2.0mL。加入0.2%的蒽酮-硫酸試劑(稱取蒽酮0.2g，加濃硫酸定容至100mL容量瓶中即得，現(xiàn)用現(xiàn)配) 4.0mL，搖勻后沸水浴10min，冷卻至室溫，用分光光度計(jì)測定620nm波長處相應(yīng)的吸光度。以測得的吸光度為橫坐標(biāo)、葡萄糖的質(zhì)量濃度/(mg/mL)為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得數(shù)據(jù)經(jīng)回歸處理，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.2471χ＋0.0009，R2=0.9963，其中，y為被測樣品中葡萄糖的質(zhì)量濃度、χ為吸光度。

1.3.2 樣品多糖含量的測定

稱取1.0g豬肚菇子實(shí)體粉末于錐形瓶中，于不同條件下進(jìn)行超聲波輔助提取，抽濾后將濾液用蒸餾水定容至50mL，準(zhǔn)確吸取0.1mL，用蒸餾水補(bǔ)充至2.0mL，再分別加入0.2%的蒽酮-硫酸試劑4.0mL，搖勻后沸水浴10min，冷卻至室溫，用分光光度計(jì)在波長620nm處測定相應(yīng)的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，由吸光度求出提取液中多糖的質(zhì)量濃度，并按照下列公式計(jì)算各處理的多糖提取率。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

以水為提取溶劑，考察提取溫度(35、45、55、65、75℃)、料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)、提取時(shí)間(20、30、50、80、100min)以及超聲功率(60%、70%、80%、90%、100%即300、350、400、450、500W)對多糖提取率的影響。每處理做3個(gè)重復(fù)。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取超聲溫度、料液比、超聲時(shí)間3個(gè)因素為自變量，以單因素試驗(yàn)得出的各最佳條件為中心點(diǎn)，以豬肚菇子實(shí)體中多糖提取率為響應(yīng)值，采用Design Expert軟件設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)方案，按照試驗(yàn)方案進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果采用Design Expert 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，優(yōu)化豬肚菇子實(shí)體多糖超聲提取的工藝參數(shù)，確定最佳試驗(yàn)方案。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溫度對多糖提取率的影響

在超聲功率400W(80%)、超聲時(shí)間30min、料液比1∶40的條件下，分別選取超聲溫度為35、45、55、65、75℃進(jìn)行超聲提取試驗(yàn)，測定并計(jì)算各處理的多糖提取率，結(jié)果如圖1所示。

圖1 超聲溫度對多糖提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic temperature on extraction yield of polysaccharides

由圖1可知，隨著超聲溫度的升高，多糖提取率逐漸增大，但在65～75℃范圍內(nèi)的提取率變化不大。因此最佳提取溫度選為70℃。

2.1.2 提取時(shí)間對多糖提取率的影響

圖2 超聲時(shí)間對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic treatment time on extraction yield of polysaccharides

在超聲功率400W(80%)、超聲溫度75℃、料液比1∶40的條件下，分別選取超聲時(shí)間為20、30、50、80、100min進(jìn)行超聲提取試驗(yàn)，測定并計(jì)算各處理的多糖提取率，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：隨著超聲提取

時(shí)間的延長，多糖提取率先增大后減小，在50min時(shí)提取率最大。因此，豬肚菇多糖提取的最佳提取時(shí)間為50min。

2.1.3 料液比對多糖提取率的影響

圖3 料液比對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of liquid-to-solid ratio on extraction yield of polysaccharides

在超聲功率400W(80%)、超聲溫度75℃、超聲時(shí)間30min的條件下，分別選取料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60進(jìn)行超聲提取試驗(yàn)，測定并計(jì)算各處理的多糖提取率，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知：隨著料液比的變化，多糖提取率先增大后減小，料液比為1∶40時(shí)提取率最大。因此，豬肚菇多糖提取的最佳料液比為1∶40。

2.1.4 超聲功率對多糖提取率的影響

圖4 超聲功率對多糖提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction yield of polysaccharides

在超聲溫度75℃、超聲時(shí)間30min、料液比1∶40條件下，分別選取超聲功率60%(300W)、70%(350W)、80%(400W)、90%(450W)、100%(500W)，進(jìn)行超聲提取試驗(yàn)，測定并計(jì)算各處理的多糖提取率，結(jié)果如圖4所示。可知，隨著超聲功率的升高，多糖提取率逐漸增大，100%(500W)時(shí)提取率最大，因此，豬肚菇多糖的最佳提取功率為100%(500W)。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定出響應(yīng)面試驗(yàn)方案的因素水平表(表1)。按照響應(yīng)面試驗(yàn)方案進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and their coded levels in the response surface analysis

表2 豬肚菇多糖超聲提取的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The experimental design and results for response surface analysis

對表2數(shù)據(jù)采用Design Expert 7.0軟件進(jìn)行處理和分析，獲得豬肚菇多糖提取率對超聲提取溫度、料液比、提取時(shí)間的二次多元回歸方程：

Y(多糖提取率)=76.36＋2.22X1＋4.94X2＋4.12X3-1.44X1X2-0.51X1X33＋0.93X2X3-4.87-6.52-6.11

表3為該模型及其各回歸系數(shù)的方差分析，由表3可知，此模型P值小于0.01(P=0.0016)，表明該響應(yīng)回歸模型達(dá)到了極顯著水平，說明該模型是有意義的。該模型的R2=0.9407，=0.8645，變異系數(shù)為5.27，說明該模型擬合程度比較好，試驗(yàn)誤差小，該模型能解釋86.45%響應(yīng)值的變化。該模型失擬項(xiàng)的P值為0.7352，說明其影響不顯著，即失擬項(xiàng)與純誤差沒有顯著差異，則說明實(shí)驗(yàn)操作可信，可以用回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。且該模型中各因素對豬肚菇多糖提取率影響的程度分別為：X2、X3影響極顯著，、影響顯著，X1、X1X2、X1X3、X2X3影響不顯著。

表3 回歸系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)Table 3 The regression coefficient and significance of each term in the fitted regression model

2.2.2 響應(yīng)面分析

圖5 各兩因素交互作用對豬肚菇多糖提取率影響的響應(yīng)曲面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots showing the interactive effects of temperature, ultrasonic treatment time and liquid-to-solid ratio on extraction yield of polysaccharides

由圖5A可知，溫度和料液比的交互作用顯著，且溫度軸向等高線變化密集，料液比軸向等高線變化相對稀疏，故料液比對響應(yīng)值峰值的影響較溫度影響大。由圖5B可知，溫度和時(shí)間的交互作用顯著，且溫度軸向等高線變化密集，時(shí)間軸向等高線變化相對稀疏，故時(shí)間對響應(yīng)值峰值的影響較溫度影響大。由圖5C可知，料液比和時(shí)間的等高線形狀趨于圓形，表明二者的交互作用不大。

通過軟件分析可以得到，當(dāng)X1=0.152、X2=0.387、X3=0.360時(shí)，豬肚菇子實(shí)體多糖提取率有一個(gè)預(yù)測的最大值78.22mg/g。進(jìn)行編碼代換后，即得到超聲波提取豬肚菇子實(shí)體多糖的最佳條件是溫度71.52℃、料液比1∶44、時(shí)間57.19min。

采用上述最優(yōu)提取條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(考慮到實(shí)際操作的情況，將多糖最佳提取條件修正為超聲時(shí)間57min、超聲溫度72℃、料液比1∶44)，實(shí)際測得的多糖得率為75.79mg/g，與模型預(yù)測值的誤差為3.1%。因此本試驗(yàn)采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化得到的超聲波提取條件參數(shù)基本準(zhǔn)確可靠，在實(shí)際應(yīng)用中具有一定的參考價(jià)值。

3 結(jié) 論

通過單因素和響應(yīng)曲面試驗(yàn)，對豬肚菇子實(shí)體中多糖的超聲提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化分析，得到超聲提取豬肚菇子實(shí)體多糖的最佳工藝條件為溫度72℃、料液比1∶44、時(shí)間57min，在此條件下多糖得率為75.79mg/g。

研究結(jié)果可為豬肚菇多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論參考，但對豬肚菇多糖的生物活性、化學(xué)結(jié)構(gòu)及其深層開發(fā)利用還有待進(jìn)一步研究。

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Optimization for Ultrasonic-assisted Extraction of Polysaccharides from Panus giganteus Fruiting Bodies via Response Surface Analysis

YANG Run-ya，YANG Shu-de，DONG Hong-xin，YUAN Ru-yue
(College of Life Science, Ludong University, Yantai 264025, China)

The ultrasonic-assisted extraction of polysaccharides from the fruiting bodies of Panus giganteus was optimized by response surface analysis based on one-factor-at-a-time experiments. Under the optimal conditions∶ 72 ℃ extraction temperature, 1∶44 material-to-water ratio and 57 min ultrasonic treatment time, the maximum extraction yield of polysaccharides was predicted to be 78.22 mg/g and observed to be 75.79 mg/g. Therefore, there was a good accordance between the predicted and observed values.

Panus giganteus；ultrasonic-assisted extraction；polysaccharide；response surface analysis

R284.2

A

1002-6630(2011)14-0029-05

2010-09-20

山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎(jiǎng)勵(lì)基金項(xiàng)目(BS2010NY003)；魯東大學(xué)食藥用真菌創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目(08CXB003)

楊潤亞(1974—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)樯镛r(nóng)藥和菌物生態(tài)學(xué)。E-mail：yry74@163.com