超聲輔助提取白背三七總黃酮

李 輝，卜曉英，陳功錫，李亞男，梁春鳳，謝依蓁

(1.吉首大學生物資源與環境學院，湖南 吉首 416000；2.植物資源保護與利用湖南省高校重點實驗室，湖南 吉首416000；3.林產化工工程湖南省重點實驗室，湖南 張家界 427000)

超聲輔助提取白背三七總黃酮

李 輝1,2，卜曉英3，陳功錫1,2，李亞男1，梁春鳳1，謝依蓁1

(1.吉首大學生物資源與環境學院，湖南 吉首 416000；2.植物資源保護與利用湖南省高校重點實驗室，湖南 吉首416000；3.林產化工工程湖南省重點實驗室，湖南 張家界 427000)

目的：超聲輔助提取白背三七干葉、鮮葉、干莖和鮮莖中的總黃酮，探討超聲促進提取的原因。方法：用單因素試驗法考察液料比、提取時間和乙醇體積分數對黃酮提取率的影響，并與常規溶劑提取法進行對比。用掃描電鏡研究超聲處理后白背三七葉片的結構改變。結果：超聲提取最優條件為每克植物材料用30mL 70%乙醇溶液提取15min，重復提取2次；對白背三七的相同部位超聲提取時，新鮮材料提取率明顯高于干的植物材料。結論：超聲提取白背三七總黃酮時，提取效率較高、時間短，其高效率可能來源于超聲波對材料表明細胞壁的強烈損傷。

超聲輔助提取；白背三七；總黃酮

白背三七(Gynura divaricata (L.) DC)為菊科三七草屬植物，其根、莖、葉均可入藥，具抗腫瘤、抗菌、降血脂、增加機體免疫力等生理活性[1]，可用于治療支氣管炎、肺結核、跌打損傷、風濕痛等疾病。白背三七富含黃酮類化合物，其葉、莖可藥食兼用[2]，具有抗病毒、清除人體超氧陰離子自由基、抗衰老之功效[3]，且生長周期短，極易栽培，因而具備較高的開發價值。植物黃酮類化合物的提取，迄今已經發展了多種方法，如常規溶劑提取法[4]、超聲輔助提取法[5-6]、超臨界流體萃取法[7]、微波輔助提取法[8]等。其中，常規溶劑提取法操作簡便，但提取混合物長時間處于高溫溶劑中，極不利于熱不穩定化合物的提??；超臨界流體萃取法，提取環境溫和，但提取成本高[9]；微波提取簡便快速，但提取化合物也是處于高溫溶劑中，且微波作用下的分子偶極改變，可能影響所提化合物的生物活性[10-11]。而超聲波輔助提取技術卻是在溫和條件下，依靠超聲空化作用削弱化合物與樣品基體的結合力，促進目標物的溶出，特別是對于新鮮植物材料，表現了更加優異的特性，因此是一種高效、低耗的綠色提取技術[12]。本實驗探討超聲提取白背三七干、鮮材料中的總黃酮。以期為白背三七總黃酮的提取提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白背三七(自采)：經植物分類學專家陳功錫教授鑒定為白背三七。將采集的白背三七葉、莖洗凈，自然風干后，白背三七干葉剪成2mm×2mm小塊，白背三七干莖剪成2mm長的小段，置于干燥器中備用。將采集的新鮮白背三七葉、莖洗凈，稍干后，葉剪成2mm× 2mm小塊，莖剪成2mm的小段，用塑料袋密封置于冰箱中備用。

乙醇(AR)、甲醇(AR) 天津市富宇精細化工有限公司；氫氧化鈉(AR) 天津市石英鐘廠霸州市化工分廠；硝酸鋁(AR) 上海振興試劑廠；亞硝酸鈉(CR) 湘中地質實驗研究所；蘆丁標準品 中國藥品生物制品鑒定所。

1.2 儀器與設備

723A型紫外-可見分光光度計、FA2004型電子天平 上海精密科學儀器有限公司；電熱恒溫干燥箱(GZXDH-40×45) 上海躍進醫療器械廠；S-3400N型掃描電子顯微鏡 日本日立集團；KQ-250E型超聲清洗盆(正常功率：250W) 昆州市超聲儀器有限公司；回流提取設備 自組裝。

1.3 超聲輔助提取方法

準確稱取待測樣品：白背三七干葉、干莖、鮮葉、鮮莖樣品3份，每份1g，按設定的液料比(mL/g，20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1)、乙醇體積分數(40%、50%、60%、70%、80%)和提取時間(5、10、15、20、25min)，在超聲功率250W條件下提取，過濾，濾渣在相同條件下重復提取2次，合并提取液，定容到200mL。每種樣品平行測定3次，取其平均值。采用單因素試驗法考察液料比、提取時間和乙醇體積分數對黃酮提取率的影響。

1.4 分光光度法測定總黃酮

1.4.1 標準曲線

以蘆丁為參照，精密稱取蘆丁對照品20mg，置于100mL量瓶中，加50%甲醇溶解至刻度，搖勻得對照品溶液。分別吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL對照品溶液置于10mL比色管中，用50%甲醇定容至5mL，加50% NaNO2溶液0.3mL，搖勻，放置6min，加0.3mL 10% Al(NO3)3，搖勻，放置6min，加4mL 4% NaOH，搖勻，放置15min后于510nm波長處測定吸光度。參比樣品不含蘆丁，按同樣方法制備。標準方程：y=29.30χ-0.1(y為吸光度，χ為質量濃度/(mg/mL))。

1.4.2 總黃酮提取率測定

吸取各提取液5.0mL于10mL比色管中，按上述標準溶液的制備方法加入試劑，以不含蘆丁樣品為參比測定各提取液中黃酮質量濃度，按下式計算總黃酮提取率：

1.4.3 白背三七樣品中總黃酮含量測定

白背三七樣品總黃酮含量用乙醇提取法進行測定[13]。平行稱取植物材料5份(每份1.0g)，加70%乙醇10mL，于85℃水浴回流1h，冷卻過濾，濾渣再用同樣量溶劑重復提取3次，合并提取液，定容，按上述標準溶液制備方法測定提取液中總黃酮質量濃度，用5份樣品的平均值作為樣品總黃酮含量。

2 結果與分析

2.1 液料比對超聲提取率的影響

圖1 不同液料比(a)、提取時間(b)及乙醇體積分數(c)條件下白背三七干葉、鮮葉、干莖、鮮莖總黃酮的超聲提取率Fig.1 Effects of material-to-liquid ratio, extraction time and ethanol concentration on extraction rates of total flavonoids from fresh and dried samples of different parts of Gynura divaricata L. DC

按液料比(mL/g)分別為20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1的溶劑用量超聲條件下提取白背三七總黃酮。提取時，干、鮮植物材料均用70%乙醇水溶液為溶劑，提取15min，重復提取2次。總黃酮提取率如圖1a所示。結果表明：對于干、鮮白背三七材料，總黃酮提取率隨液料比的增加而增大，但當液料比超過30∶1時，提取率趨于穩定。從圖1a也可發現，相同條件下對于植物同一部位的超聲提取，如葉、莖，新鮮材料的提取率要高于干的植物材料。這可能是由于超聲波作用于新鮮植物材料時，對植物細胞壁的破碎作用更為強烈所致。

2.2 提取時間對黃酮超聲提取率的影響

超聲條件下，每克植物材料用30mL 70%乙醇溶液進行提取，提取時間分別為5、10、15、20、25min，每份材料重復提取2次，黃酮提取率如圖1b所示。提取率先隨時間增加而增大，但當提取時間超過15min時，提取率反而降低，這表明超聲提取植物材料的時間不宜過長。對植物材料的相同部位，提取時間相同時，新鮮材料的提取率明顯高于干的材料。特別在提取時間較短時，超聲提取新鮮材料的優越性更加明顯。

2.3 乙醇體積分數對超聲提取率的影響

基于所提取化合物在溶劑中的溶解度差異，分別使用40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液為溶劑提取總黃酮。液料比保持30∶1，超聲處理時間15min，重復提取2次結果見圖1c。由圖1c可知，對于所有材料，超聲提取率隨乙醇體積分數增加而增大，當乙醇體積分數增加到70%以上時，提取率趨于穩定。但在提取新鮮植物材料時，仍可觀察到比干的植物材料高的提取率。

通過單因素試驗可得，最優的提取條件為液料比30∶1、70%乙醇溶液、超聲處理時間15min。且在相同的條件下，植物同一部位新鮮材料的提取率要高于干的植物材料。

2.4 超聲輔助提取法與常規方法的比較

稱取白背三七新鮮葉片2份，每份3.0g，使用相同的溶劑(70%乙醇溶液)和液料比(30∶1)，分別用超聲輔助提取法和回流法進行提取，超聲提取15min，回流提取2.5h，結果見表1。由表1可知，兩種方法提取相同的植物材料時，超聲法可在較短時間得到與常規回流提取較長時間相似的提取率，表明超聲輔助提取法的效率更高。

表1 超聲輔助提取與回流法提取白背三七總黃酮比較Table 1 Comparison of ultrasonic-assisted extraction and refluxing extraction of total flavonoids from Gynura divaricata L. DC leaves

2.5 超聲波對植物葉片表面的作用

提取效率與植物細胞內容物透過細胞壁進入溶劑的溶出過程緊密相關。通常情況下，由于細胞壁內外物質的濃度差，借助于分子運動，胞內物質會通過擴散作用穿過細胞壁而進入溶液。如能借助外力作用破壞植物細胞壁的結構，則會大大加速細胞內物質向溶劑的擴散速度，提高提取效率。為探究超聲提取植物材料時的高效率，用掃描電鏡觀察新鮮白背三七葉片通過超聲處理和回流處理后的表面結構變化，如圖2所示(放大100倍)?？梢园l現，超聲處理后的植物葉片表面損傷嚴重，而常規回流處理后的葉片表面仍較完整。這表明超聲波與溶劑中的植物材料作用時，對其細胞壁具有較強的破壞作用，從而加速了細胞內容物的溶出過程。

圖2 超聲提取(a)和回流提取(b)后白背三七葉面掃描電鏡圖Fig.2 SEM photographs of Gynura divaricata L. DC leaves after ultrasonic-assisted extraction and refluxing extraction

3 結 論

超聲提取白背三七總黃酮時，當每克植物材料使用30mL 70%乙醇溶液提取15min，重復提取2次，黃酮提取率最高。對白背三七的相同部位，超聲提取新鮮材料時提取率明顯高于干的植物材料。超聲提取白背三七鮮葉時，處理15min可以得到與常規回流提取2.5h相似的黃酮提取率。超聲波輔助提取植物材料的高效率來源于超聲波的空化作用對植物細胞壁的損傷，從而促進了細胞內含物質的溶出。

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Ultrasonic-assisted Extraction of Total Flavonoids from Gynura divaricata L. DC

LI Hui1,2，BU Xiao-ying3，CHEN Gong-xi1,2，LI Ya-nan1，LIANG Chun-feng1，XIE Yi-zhen1
(1. College of Biology Resources and Environmental Science, Jishou University, Jishou 416000, China；2. Key Laboratory of Plant Resource Conservation and Utilization of College of Hunan Province, Jishou 416000, China；3. Key Laboratory of Forstry Product and Chemical Engineering of Hunan Province, Zhangjiajie 427000, China)

Objective∶ To optimize the ultrasonic-assisted extraction (UAE) of total flavonoids from dried and fresh leaves and stems of Gynura divaricata L. DC and explore the mechanisms by which ultrasonic can enhance the extraction of total flavonoids. Methods∶ The effects of material-to-liquid ratio, extraction time and ethanol concentration on extraction rate of total flavonoids were explored by single factor experiments. Scanning electron microscope (SEM) was utilized for examining the structural change of Gynura divaricata L. DC leaves after ultrasonic treatment. Results∶ The optimal UAE conditions were material-to-liquid ratio of 1∶ 30 (g/mL); extraction time of 15 min, ethanol concentration of 70%, and number of repeated extractions of 2. Under these conditions, the extraction rate of total flavonoids from the same parts of fresh Gynura divaricata L. DC was higher than that from dried Gynura divaricata L. DC. Conclusion∶ UAE method has many advantages over conventional solvent extraction such as higher extraction efficiency and shorter extraction time, which is possibly due to severe damage of Gynura divaricata L. DC cell wall by ultrasound.

ultrasonic-assisted extraction (UAE)；Gynura divaricata L. DC；total flavonoids

R284.2；O623.54

A

1002-6630(2011)14-0144-03

2010-09-04

湖南省教育廳優秀青年項目(06B076)

李輝(1968—)，男，副教授，博士，研究方向為生命科學中的分離分析新方法。E-mail：lihuijsdx@163.com