人嗜堿性粒細胞腫瘤細胞系KU812F檢測牛乳及其替代品致敏性方法的建立

叢艷君，任發政

(1.北京工商大學食品學院，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京市食品風味化學重點實驗室，北京100048；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083)

人嗜堿性粒細胞腫瘤細胞系KU812F檢測牛乳及其替代品致敏性方法的建立

叢艷君1，任發政2,*

(1.北京工商大學食品學院，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京市食品風味化學重點實驗室，北京100048；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083)

比較牛乳及其替代品釋放組胺的能力，以建立體外細胞檢測牛乳及替代品疑似過敏原組分致敏性的檢測方法。以嗜堿性粒細胞KU812F為研究對象，通過牛乳過敏患者血清的孵育，使細胞處于致敏狀態，再以牛乳及其替代品過敏原作為激發物，使細胞脫顆粒釋放組胺。結果表明：利用嗜堿性粒細胞KU812F檢測牛乳及替代制品組胺釋放量的方法具有較高的可靠性及重現性，細胞釋放組胺的量與過敏原的劑量相關，在一定的劑量范圍內，組胺的釋放率與過敏原的劑量呈正比，組胺釋放率達到最大之后，組胺釋放率與劑量呈負相關。

KU812F；組胺；過敏反應；牛乳粉

嗜堿性粒細胞在食物超敏反應中起著初級效應細胞的作用，過敏原初次進入過敏體質的機體，刺激機體產生特異性IgE抗體，IgE與嗜堿性粒細胞結合，形成致敏嗜堿性粒細胞，此時機體處于致敏狀態，相應變應原再次進入處于致敏狀態的機體，通過與致敏嗜堿性粒細胞表面緊密相鄰的特異性IgE“橋聯”結合，使致敏的細胞脫顆粒，釋放組胺、白三烯、激肽和嗜酸性粒細胞趨化因子等一系列具有生物活性的介質，介質作用于效應器官與組織，而產生一系列的臨床癥狀[1-2]。

組胺釋放是評價過敏原致敏性的常用指標，常用的方法是從過敏患者或致敏動物的周邊血液中提取嗜堿性粒細胞進行即時檢測，評價過敏原致敏性[3-5]，但是提取靶細胞的復雜工藝及細胞不能長期保存的缺點限制了此種方法的長期連續應用。本實驗應用株化的嗜堿性粒細胞腫瘤細胞系建立體外檢測牛乳及替代品疑似過敏原組分致敏性的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗材料包括液態奶和嬰兒配方粉，液態奶有牛乳、山羊奶、驢奶和水牛奶，每種液態奶是50份奶樣的等體積混合物，巴氏殺菌奶由實驗室自制(牛奶65℃加熱30min)，另外從全國收集母乳100份，混合備用，嬰兒配方粉包括伊利金冠、雀巢能恩、多美滋金盾，水解物配方粉和氨基酸配方粉由伊利集團技術中心友情提供。

KU812F美國模式菌種收集中心(ATCC)、組胺定量檢測試劑盒(ELISA) 上海江萊生物科技有限公司；胎牛血清、細胞培養板、人IgE抗體 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

S21-1恒溫磁力攪拌器 上海司樂儀器廠；YCP-100 CO2細胞培養箱 北京市英博聯科技發展有限公司；TDL-50B低速離心機 上海安亭儀器廠；XDS200-PH倒置相差顯微鏡 北京中顯恒業儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛奶過敏患者血清的篩選

牛奶過敏患者血清由北京大學第三醫院皮膚科友情提供，牛乳過敏患者篩選參照文獻[6-7]，收集的血清用于細胞的敏化。本研究將5份血清混合，混合血清特異性IgE含量為41.2kU/L。

1.3.2 KU812F嗜堿性粒細胞的復蘇、傳代培養

根據KU812F說明書提供的方法進行細胞復蘇、傳代培養實驗。37℃水浴復蘇細胞株，在超凈臺內把盛有細胞株的凍存管從水浴中取出，用體積分數70%乙醇溶液擦拭凍存管管身，然后從凍存管中吸取0.5mL細胞液，緩慢添加以5mL/min的速度加入4.5mL RPMI-1640培養基(含體積分數10%的胎牛血清、2mmol/L L-谷氨酸、10mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液(HEPES)中，125×g離心5min，取細胞。

以培養基重懸細胞，稀釋到2×105，在培養箱中培養，次日更換培養基，以后一般每2d更換一次培養基。

取細胞密度不超過1×106/mL的細胞液，125×g離心5min，除去上清液，加入新的培養液，吹打成細胞懸液，計數、分裝。

1.3.3 組胺釋放率的測定[8]

選用12孔細胞培養板，每孔2mL細胞懸液，每孔1×106個細胞，用臺式液(137mmol/L NaCl、2.7mmol/L KCl、1.8mmol/L CaCl2、1.1mmol/L MgCl2、11.9mmol/L NaHCO3、0.4mmol/L NaH2PO4、5.6mmol/L葡萄糖組成的溶液，pH7.2)洗2次，加入25μg/mL的人的IgE抗體，以促進細胞高親和力受體高效表達，然后加入牛乳過敏患者混合血清2mL，加入10μg/mL抗人IgE抗體，37℃孵育4h，然后4℃、300×g離心10min，測定上清組胺含量，所得結果作為陽性對照。

取12孔細胞培養板，每孔2mL細胞懸液，每孔1×106個細胞，用臺式液洗2次，加入25μg/mL的人IgE抗體，以促進細胞高親和力受體高效表達，然后加入待測樣品，待測過敏原樣品一般以1.0μg/mL為初始質量濃度，以10倍梯度稀釋，再加入牛乳過敏患者血清，37℃孵育4h，然后立即4℃、300×g離心10min，測定待測樣品上清液組胺含量。以不加待測樣品作為陰性對照組。將細胞用超聲破碎后，測定總組胺含量。上清液和細胞內外總組胺含量均用組胺定量檢測試劑盒進行測定。

1.4 方法的重現性與精確度的驗證

選用12孔細胞培養板，每孔2mL細胞懸液，每孔1×106個細胞，用臺式液洗2次，加入25μg/mL的人IgE抗體，然后再加入10μg/mL抗人IgE抗體，加入牛乳過敏患者血清，37℃敏化4h，然后4℃、300×g離心10min，測定上清組胺含量。以不加抗人IgE抗體作為陰性對照組。將細胞用超聲破碎后，測定總組胺含量。上清液和細胞內外總組胺含量均用人組胺定量檢測試劑盒進行測定。其中抗人IgE標準品配成5種不同的稀釋質量濃度——0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL，每種質量濃度均計算嗜堿性粒細胞釋放組胺率/%。以批內誤差和批間誤差來表示該方法的精確度與可靠性。批內誤差：抗人IgE質量濃度作4次重復，計算標準差，以其組內變異系數表示批內誤差；批間誤差：不同時間重復此實驗，測定組胺釋放率，計算出標準差和變異系數，以組內變異系數表示批間誤差。

2 結果與分析

2.1 精確度實驗

表1 組胺釋放率的批內精確度Table 1 Intra-plate accuracy of histamine release

由表1可知，變異系數最大值為0.075%、最小值為0.001%，批內具有較好的精確性。比較3次測定的組胺釋放量的平均值，求出各質量濃度的批間標準差，再計算出變異系數，結果見表2，變異系數在0.001%～0.002%，批間同樣具有較好的精確性。鑒于批內、批間數據的精確性，因此利用嗜堿性粒細胞KU812F檢測牛乳及替代制品組胺釋放量的數據具有較高的可靠性及重現性。

表2 組胺釋放率的批間精確度Table 2 Inter-plate accuracy of histamine release

2.2 KU812F測定牛乳及其替代品致敏性的應用

圖1 KU812F檢測牛乳及替代品組胺釋放率Fig.1 Histamine release from KU812F basophils after sensitization with cow milk or its substitutes at different concentrations

如圖1所示，嗜堿性粒細胞組胺釋放率與過敏原的激發量密切相關，原料乳和巴氏殺菌奶在0.1μg/mL時組胺釋放率最大，全蛋白嬰兒配方粉在1μg/mL時組胺釋放率最大；不同乳及制品間，在同一劑量粗蛋白激發下，組胺釋放率均存在差異，如在0.1μg/mL條件下，牛奶作為細胞過敏原刺激物組胺釋放率最高，其次依次為水牛奶、羊奶、驢奶，4種全蛋白配方粉組胺釋放率也較低，差異顯著(P＜0.05)。氨基酸配方粉組胺釋放率高于全蛋白配方粉的組胺釋放率。

3 討 論

現有技術中用于檢測牛乳過敏原的方法有多種。其中，皮膚試驗在臨床應用極為普遍[9]，被認為是過敏原評價的較為合理的方法，這種方法雖簡便、快速，但其操作不安全、假陽性或假陰性的結果出現率也很高。體外檢測技術主要有酶聯免疫吸附實驗、放射過敏原吸附實驗、高壓液相層析法等[10-12]，放射免疫法費用昂貴且放射性同位素易污染環境，高效液相法儀器成本高、耗時費力，酶聯免疫方法快速、方便，目前在過敏原檢測方面應用比較多，但是這種方法主要對食品中致敏蛋白質檢測比較準確，如果產品中蛋白質水解為多肽，由于包被洗滌過程中部分多肽的流失，ELISA方法就不準確了。相對而言，組胺釋放試驗更接近臨床試驗，已作為皮膚試驗的有效替代方法，在許多免疫學研究中得到比較廣泛的應用[13-14]。

本研究以嗜堿性粒細胞KU812F為研究對象，通過牛乳過敏患者血清的孵育，使細胞處于致敏狀態，再加入牛乳及其替代品過敏原，使細胞脫顆粒釋放組胺，比較牛乳及其替代品釋放組胺的能力。Yamaguchi等[15]研究表明，在細胞培養過程中加入IgE可以提高細胞高親和力受體表達水平，本研究在測定組胺釋放率實驗中，為了提高組胺的釋放量，提高實驗數據的精確性，使用了人IgE抗體。Shim等[8]用人嗜堿性粒細胞腫瘤細胞系KU812和KU812F探索了體外檢測過敏原過敏性反應的方法，發現KU812F傳代穩定，分化能力強，易于培養，具有較高的FсεRI表達能力和組胺釋放能力。本實驗在該研究基礎上優化了細胞傳代培養的方法，驗證了過敏原激發嗜堿性粒細胞釋放組胺方法的可重復性和精確性，并成功應用于乳及乳制品致敏性的檢測。嗜堿性粒細胞組胺釋放量與過敏原的激發量密切相關，原料乳和巴氏殺菌奶在0.1μg/mL組胺釋放率最大，全蛋白嬰兒配方粉在1μg/mL組胺釋放率最大，這種現象出現的原因可能是由于不同樣品粗蛋白中過敏原含量差異所致；不同乳及制品間，在同一劑量粗蛋白激發下，組胺釋放率均存在差異，原因可能是在加工過程中乳蛋白與其他成分發生復雜的反應屏蔽了作用表位所致。

本研究初步探索了牛乳及制品體外激發嗜堿性粒細胞釋放組胺的規律，廣泛應用于過敏原致敏性的篩選檢測有待于深入研究，要建立統一的檢測標準，包括明確血清孵育量、細胞株培養保存方法、過敏原激發量、組胺檢測方法等。

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Construction of an in vitro Allergy Reaction Evaluation Method for Cow Milk and Its Substitutes Using Human Leukemia Cell Line KU812F

CONG Yan-jun1，REN Fa-zheng2,*
(1. Beijing Key Laboratory of Food Flavor Chemistry, Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, School of Food and Chemical Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China；2. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

This study aimed to construct an in vitro cellular assay for suspected allergenic components of cow milk and its substitutes using human leukemia cell line KU812F, an immature prebasophillic cell line based on their histamine release ability. KU812F was differentiated into basophils by incubation with serum from cow milk allergic people. The release of histamine from differentiated KU812F cells was monitored after sensitization with either cow milk or its substitutes. The results showed that this in vitro assay was highly reliable and reproducible in determining histamine release from KU812F cells after respective sensitization with cow milk and its products. Cow milk and its substitutes differed in their histamine release ability. Cow milk allergen induced histamine release in a dose-dependent manner. Specifically, a positive relationship was observed in a defined range of allergen dose, followed by a negative relationship after maximum histamine release.

KU812F；histamine；allergy；cow milk powder

TS207.3

A

1002-6630(2011)14-0202-04

2011-03-12

北京市教育委員會科技計劃面上項目(KM201110011003)

叢艷君(1978—)，女，講師，博士，研究方向為功能乳制品。E-mail：congyj@th.btbu.edu.cn

*通信作者：任發政(1962—)，男，教授，博士，研究方向為功能乳制品。E-mail：renfazheng@263.net