多壁碳納米管基質(zhì)固相分散-高效液相色譜測定牛奶中6種四環(huán)素

王學(xué)翠，劉 冰，張璐鑫，季晶晶，施金秋，張 航，楊宗惠，吳 宏

(徐州師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，江蘇省功能材料綠色合成重點實驗室，江蘇 徐州 221116)

多壁碳納米管基質(zhì)固相分散-高效液相色譜測定牛奶中6種四環(huán)素

王學(xué)翠，劉 冰，張璐鑫，季晶晶，施金秋，張 航，楊宗惠，吳 宏*

(徐州師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，江蘇省功能材料綠色合成重點實驗室，江蘇 徐州 221116)

以多壁碳納米管為吸附材料，建立基質(zhì)固相分散萃取高效液相色譜法測定牛奶中6種四環(huán)素。將多壁碳納米管、EDTA、草酸和樣品研磨混勻裝柱，經(jīng)含甲酸的甲醇洗脫后HPLC多波長紫外檢測。6種四環(huán)素的檢出限0.01～0.03μg/mL，回收率78.7%～105.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于12%。多壁碳納米管基質(zhì)固相分散萃取牛奶中四環(huán)素的回收率優(yōu)于C18，可推廣到食品等復(fù)雜樣品中其他農(nóng)獸藥多殘留分析。

四環(huán)素；基質(zhì)固相分散；碳納米管；高效液相色譜法

四環(huán)素類(tetracyclines，TCs)抗生素為廣譜抗菌藥，對革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌、立克次氏體等均有抑制作用[1]。在預(yù)防和治療畜禽疾病過程中，由于藥物不合理使用，可能導(dǎo)致在動物性食品及牛奶中四環(huán)素類藥物的殘留問題[2]。在已報道的四環(huán)素類抗生素檢測方法中，微生物法一般用于總量測定，酶聯(lián)免疫法用于個別四環(huán)素測定，薄層色譜法用于限量分析[3]，而毛細(xì)管電泳法和液相色譜法則用于多種四環(huán)素類抗生素同時測定。高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)分離結(jié)合紫外[4]、二極管陣列[1,5]、熒光[6]、電化學(xué)[7]、化學(xué)發(fā)光[3]和質(zhì)譜[2,8]檢測，是牛奶中四環(huán)素類抗生素殘留分析的主要手段。

高效液相色譜分析前的樣品提取和凈化步驟十分重要。與固相萃取技術(shù)[9]相比，基質(zhì)固相分散(matrix solid phase dispersion，MSPD)集樣品勻化、提取和凈化過程于一體，操作更加簡單[10-11]。MSPD常用的吸附劑主要有C18、硅藻土和硅膠，但有些應(yīng)用的選擇性不高[12]。基于新型吸附材料碳納米管的固相萃取技術(shù)在農(nóng)獸藥殘留分析中已有一些報道[13-14]，但在MSPD中的應(yīng)用還很少[15]。本實驗旨在建立多壁碳納米管材料MSPD技術(shù)，結(jié)合高效液相色譜多波長檢測牛奶中6種四環(huán)素類抗生素。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽酸四環(huán)素、脫水四環(huán)素、鹽酸金霉素、土霉素、美他環(huán)素和多西環(huán)素對照品 中國藥品生物制品檢定所；甲醇、乙腈(色譜純) 德國Merck公司；甲酸、檸檬酸、磷酸氫二鈉和乙二胺四乙酸二鈉均為分析純；所用水為重蒸水。

多壁碳納米管(直徑40～60nm，長度5～15μm，純度≥95%) 深圳納米港有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1200高效液相色譜儀(配置二元泵、自動進(jìn)樣器、多波長紫外檢測器及ChemStation工作站) 美國Agilent公司。

1.3 儀器條件

色譜柱：EclipseXDB-C18柱(150mm×2.1mm，5μm)；流動相：0.01mol/L甲酸(A)-甲醇-乙腈(1∶3，B)；流速0.3mL/min；進(jìn)樣體積20μL；柱溫25℃；檢測波長355nm；洗脫梯度：0min(20% B)→2min(25% B)→4min (30% B)→6min(35% B)→13min(40.0% B)→14min(60% B)→15.0min(20% B)，共15min。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

分別準(zhǔn)確稱取一定量的6種四環(huán)素對照品，用甲醇溶解定容配制成1000μg/mL貯備液。分別吸取適量標(biāo)準(zhǔn)貯備液，配制成10.0μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，置冰箱避光存放。

1.5 多壁碳納米管氧化處理

稱取2g多壁碳納米管于圓底蒸餾瓶中，加入100mL濃硝酸，120℃回流1h。冷卻后，用蒸餾水洗至中性，烘干后保存?zhèn)溆谩?/p>

藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)變更后的發(fā)布渠道不統(tǒng)一，不同地域的生產(chǎn)企業(yè)、藥檢機構(gòu)難以及時獲取。針對《中國藥典》、部（局）頒標(biāo)準(zhǔn)等成冊標(biāo)準(zhǔn)和注冊標(biāo)準(zhǔn)等單行頁標(biāo)準(zhǔn)，在使用過程中發(fā)現(xiàn)的問題以及試行標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)正、藥品標(biāo)準(zhǔn)修訂等，國家藥典委員會、國家藥監(jiān)局藥品注冊管理部門等每年均發(fā)布大量的標(biāo)準(zhǔn)勘誤、標(biāo)準(zhǔn)修訂等信息，尤其是單行頁標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布，有關(guān)部門只將此類標(biāo)準(zhǔn)發(fā)送到省級藥品監(jiān)督管理部門和相關(guān)生產(chǎn)單位，大多數(shù)市（地）級藥檢機構(gòu)以及有關(guān)藥品生產(chǎn)企業(yè)，由于信息不暢，無法及時獲取，對藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的執(zhí)行和藥品監(jiān)管有一定影響。

1.6 MSPD樣品處理

稱取0.5g氧化的多壁碳納米管置于玻璃研缽中，分別加入0.05g乙二胺四乙酸二鈉和草酸，將2mL牛奶樣品加至多壁碳納米管填料上，輕輕研磨成為均勻的樣品混合物。在底部填充玻璃棉的玻璃注射器中，依次加入1.0g硫酸鈉、1.5g Florisil硅土、樣品混合物和0.5g硫酸鈉。壓緊填料后，濾紙覆蓋。以1mL/min流速，用5mL含0.01mol/L甲酸的甲醇溶液洗脫。氮氣吹干洗脫液，用1.0mL流動相溶解殘渣，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，供HPLC分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長選擇

比較6種四環(huán)素類抗生素在268、270、355、360nm不同波長處的紫外吸收響應(yīng)。結(jié)果表明：在355nm波長處，鹽酸四環(huán)素、美他環(huán)素、多西環(huán)素、土霉素、鹽酸金霉素均有較強吸收，且分離效果好，而脫水四環(huán)素則出現(xiàn)倒峰；在270nm波長處，脫水四環(huán)素有較強吸收，但其余5種四環(huán)素吸收不強。綜合考慮，選擇355nm為5種四環(huán)素的檢測波長，而270nm為脫水四環(huán)素的檢測波長。

2.2 流動相選擇

文獻(xiàn)[2,4,16]報道了HPLC測定四環(huán)素類藥物的幾種流動相組成。本實驗考察比較0.01mol/L三氟乙酸-甲醇、0.01mol/L草酸-乙腈和0.01mol/L甲酸(A)-甲醇-乙腈(1∶3，B)3種流動相。結(jié)果表明，選擇0.01mol/L甲酸(A)-甲醇-乙腈(1∶3，B)作為流動相，20min內(nèi)6種抗生素基線分離，且無試劑峰的干擾。因為甲酸作為流動相能降低樣品的pH值，提高四環(huán)素類藥物的洗脫效率。

2.3 梯度洗脫程序的選擇

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure for tetracyclines separation

圖1 6種四環(huán)素類抗生素的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of 6 TCs standards

2.4 MSPD吸附劑的比較

C18是MSPD萃取中常用的吸附劑[10-11,16]，本實驗比較了多壁碳納米管和C18兩種不同吸附的MSPD萃取效果。圖2分別為多壁碳納米管和C18材料的MSPD萃取牛奶加標(biāo)樣品色譜圖。結(jié)果表明，基于多壁碳納米管的MSPD對牛奶中6種四環(huán)素類抗生素的萃取效率優(yōu)于C18材料，特別是對土霉素和鹽酸四環(huán)素萃取效果改善非常明顯。

圖2 C18材料(A)和多壁碳納米材料(B)MSPD萃取牛奶加標(biāo)樣品色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of spiked milk with matrix solid-phase dispersion using C18

表2 6種四環(huán)素類抗生素的線性回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear regression equations, correlation coefficients and limit of detections of 6 tetracyclines

2.7 方法的回收率和精密度

在市售牛奶樣品中準(zhǔn)確加入6種四環(huán)素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備添加水平為0.2μg/mL和0.4μg/mL的加標(biāo)樣品。按每個添加水平樣品重復(fù)測定3次，回收率和精密度(RSD)見表3。由表3可知，6種四環(huán)素的回收率在78.7%～105.2%之間，精密度均小于12%。

表3 兩種加標(biāo)水平下6種四環(huán)素的回收率和精密度(n=3)Table 3 Recoveries and precisions for 6 tetracyclines at two spiked levels (n=3)%

2.5 洗脫液選擇及其用量影響

牛奶加標(biāo)樣品經(jīng)多壁碳納米材料MSPD處理，分別用甲醇、乙腈及含甲酸的甲醇溶液洗脫，比較發(fā)現(xiàn)含甲酸的甲醇溶液洗脫效果最好。優(yōu)化了洗脫劑的濃度和用量，結(jié)果表明：用0.01mol/L甲酸的甲醇溶液5mL進(jìn)行洗脫，6種四環(huán)素的回收率在75%以上。

2.6 線性范圍和方法檢出限

吸取適量的10.0μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以流動相為溶劑，配制6種四環(huán)素質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。在優(yōu)化條件下，多壁碳納米管MSPD萃取后HPLC測定。以峰面積為縱坐標(biāo)，以相對應(yīng)的標(biāo)液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。檢出限為加標(biāo)樣品RSN=3時相應(yīng)的質(zhì)量濃度。線性方程、相關(guān)系數(shù)(r)及檢出限見表2。

3 結(jié) 論

研究建立了多壁碳納米管基質(zhì)固相分散萃取牛奶中6種四環(huán)素類抗生素的高效液相色譜多波長紫外測定方法。方法條件易于控制，結(jié)果準(zhǔn)確，加標(biāo)回收率穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。多壁碳納米管基質(zhì)固相分散萃取處理牛奶樣品中6種四環(huán)素類抗生素的回收率明顯優(yōu)于C18。新型吸附材料多壁碳納米管構(gòu)建的基質(zhì)固相分散萃取系統(tǒng)，成本低廉，易于推廣到食品等復(fù)雜樣品中其他農(nóng)獸藥多殘留分析。

[1]TSAI W H, HUANG T C, CHEN H H, et al. Determination of tetracyclines in surface water and milk by the magnesium hydroxide coprecipitation method[J]. Journal of Chromatography A, 2010, 1217 (3)∶ 415-418.

[2]岳振峰, 邱月明, 林秀云, 等. 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶中四環(huán)素類抗生素及其代謝產(chǎn)物[J]. 分析化學(xué), 2006, 34(9)∶ 1255-1259. [3]張琰圖, 章竹君, 孫永華. 高效液相色譜化學(xué)發(fā)光法檢測牛奶中殘留四環(huán)素類化合物的研究[J]. 化學(xué)學(xué)報, 2006, 64(24)∶ 2461-2466.

[4]佘永新, 柳江英, 呂曉玲, 等. RP-HPLC法快速檢測牛奶中7 種四環(huán)素類藥物殘留量[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(12)∶ 157-161.

[5]TSAI W H, HUANG T C, HUANG J J, et al. Dispersive solid-phase microextraction method for sample extraction in the analysis of four tetracyclines in water and milk samples by high-performance liquid chromatography with diode-array detection[J]. Journal of Chromatography A, 2009, 1216(12)∶ 2263-2269.

[6]SPISSO B F, JESUS A L O, JUNIOR M A G, et al. Validation of a highperformance liquid chromatographic method with fluorescence detection for the simultaneous determination of tetracyclines residues in bovine milk[J]. Analytica Chimica Acta, 2007, 58(1)∶ 108-117.

[7]ZHAO Funian , ZHANG Xuezhu, GAN Yiru. Determination of tetracyclines in ovine milk by high-performance liquid chromatography with a coulometric electrode array system[J]. Journal of Chromatography A, 2004, 1055(1/2)∶ 109-114.

[8]KOESUKWIWAT U, JAYANTA S, LEEPIPATPIBOON N. Validation of a liquid chromatography-mass spectrometry multi-residue method for the simultaneous determination of sulfonamides, tetracyclines, and pyrimethamine in milk[J]. Journal of Chromatography A, 2007, 1140(1/ 2)∶ 147-156.

[9]秦燕, 陳毓芳, 林峰, 等. 固相萃取-高效液相色譜法同時測定牛奶中的多種四環(huán)素殘留[J]. 食品科學(xué), 2005, 26(3)∶ 202-203.

[10]BARKER S A. Matrix solid phase dispersion (MSPD)[J]. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 2007, 70(2)∶ 151-162.

[11]CAPRIOTTI A L, CAVALIERE C, GIANSANTI P, et al. Recent developments in matrix solid-phase dispersion extraction[J]. Journal of Chromatography A, 2010, 1217(16)∶ 2521-2532.

[12]王榮艷, 王培龍, 佘永新, 等. 分子印跡基質(zhì)固相分散-液相色譜法測定牛奶中的氯霉素殘留[J]. 分析試驗室, 2009, 28(8)∶ 26-28.

[13]FANG Guozhen, HE Jinxing, WANG Shuo. Multiwalled carbon nanotubes as sorbent for on-line coupling of solid-phase extraction to high-performance liquid chromatography for simultaneous determination of 10 sulfonamides in eggs and pork [J]. Journal of Chromatography A, 2006, 1127(1/2)∶ 12-17.

[14]RAVELO-PEREZ L M, HERRERA-HERRERA A V, HERNANDEZBORGES J, et al. Carbon nanotubes∶ Solid-phase extraction[J]. Journal of Chromatography A, 2010, 1217(16)∶ 2618-2641.

[15]FANG Guozhen, MIN Guang, HE Jinxing, et al. Multiwalled carbon nanotubes as matrix solid-phase dispersion extraction absorbents to determine 31 pesticides in agriculture samples by gas chromatographymass spectrometry[J]. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 2009, 57(8)∶ 3040-3045.

[16]宋歡, 林勤保, 連庚寅, 等. 基質(zhì)固相分散-高效液相色譜法測定兔肉中四環(huán)素類藥物多殘留[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(1)∶ 250-252.

Determination of 6 Tetracycline Antibiotics in Milk by Matrix Solid-Phase Dispersion Extraction Using Multiwalled Carbon Nanotubes Coupled with HPLC

WANG Xue-cui，LIU Bing，ZHANG Lu-xin，JI Jing-jing，SHI Jin-qiu，ZHANG Hang，YANG Zong-hui，WU Hong*
(Jiangsu Key Laboratory of Green Synthetic Chemistry for Functional Materials, School of Chemistry and Chemical Engineering, Xuzhou Normal University, Xuzhou 221116, China)

A matrix solid-phase dispersion extraction (MSPDE) method was developed to extract 6 tetracycline antibiotics (TCs) from milk samples using multiwalled carbon nanotubes (MWCNTs) as adsorbent prior to high performance liquid chromatography (HPLC) determination. Milk samples, MWCNTs, oxalic acid, and EDTA were evenly ground and then packed into a glass syringe as dispersion column. The analytes were eluted with methanol containing formic acid, and detected by HPLC with variable wavelength detector at 365 nm. The limits of detection (LODs) for 6 TCs ranged from 0.01 to 0.03μg/mL. Their recoveries in spiked milk samples were in the range of 78.7%-105.2% with relative standard deviations of less than 12%. MSPD exhibited higher recovery in extracting 6 TCs as compared to C18column extraction, suggesting that the developed MSPD procedure can be applied for the multiresidues analysis of pesticides and veterinary drugs in foods.

tetracycline antibiotics；matrix solid-phase dispersion extraction；carbon nanotubes；high performance liquid chromatography

O657. 7

A

1002-6630(2011)14-0206-04

2010-10-18

國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗檢疫總局項目(2009IK131)；江蘇省自然科學(xué)基金項目(BK2008121)；

徐州市科技計劃項目(XM08C026)

王學(xué)翠(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為分離分析。E-mail：wangxc1978@126.com

*通信作者：吳宏(1968—)，男，教授，博士，研究方向為食品分析樣品前處理技術(shù)。E-mail：wuhong1968@hotmail.com