高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)醬油中7種防腐劑

夏 靜，張敬軒，李 揮，楊 嵐，吳春敏

(河北省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北省 石家莊 050051)

高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)醬油中7種防腐劑

夏 靜，張敬軒，李 揮*，楊 嵐，吳春敏

(河北省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北省 石家莊 050051)

建立利用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定調(diào)味品中苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸及對(duì)羥基苯甲酸甲、乙、丙、丁酯7種防腐劑的方法。該方法中醬油樣品經(jīng)Oasis HLB柱進(jìn)行固相萃取凈化后用Warters-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，乙酸銨-乙腈溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，并在230、260nm波長(zhǎng)處檢測(cè)，結(jié)果在0.4～100mg/L的線性范圍內(nèi)測(cè)得7種物質(zhì)的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.9994，方法檢出限介于0.28～0.55mg/L之間，各個(gè)組分的回收率范圍在84.4%～102.3%之間。該方法可以應(yīng)用于測(cè)定這7種物質(zhì)在醬油中的含量。

醬油；高效液相色譜；防腐劑

我國(guó)目前醬油行業(yè)中，使用量最大的防腐劑主要是苯甲酸及其鹽類(lèi)，且GB 2760—2007《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定其最大添加量為0.1%[1]，F(xiàn)AO/ WTO(1984年)規(guī)定，ADI值為0～5mg/(kg·d)[2]。隨著人們對(duì)食品的安全性、功能性、營(yíng)養(yǎng)性的飲食理念不斷提高，國(guó)民對(duì)于食品防腐劑的安全性也提出了更高的要求。越來(lái)越多類(lèi)別的食品添加劑被用到調(diào)味品的防腐處理中，其中以對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)[3]和乳酸鏈球菌素(Nisin)[4]和脫氫乙酸[5]等安全、低毒、高效的新型防腐劑居多。針對(duì)這種形勢(shì)的發(fā)展，也給檢測(cè)工作者提出了更高的要求。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及大部分的文獻(xiàn)中規(guī)定了食品中苯甲酸鹽類(lèi)及山梨酸鹽類(lèi)采用的是高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定[6-12]，對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)則多采用氣相色譜法測(cè)定[13]，而且所測(cè)樣品主要集中于化妝品類(lèi)，脫氫乙酸也可采用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定[14-15]，鑒于國(guó)標(biāo)方法已能夠滿(mǎn)足日常檢驗(yàn)的需要，但為了提高本實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)?zāi)芰蜋z驗(yàn)效率，需要找到一種可以同時(shí)測(cè)定多種防腐劑的方法。高效液相色譜法同時(shí)具備分離效率高、靈敏度高和重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，因此，應(yīng)是目前進(jìn)行上述物質(zhì)分析的首選方法。此外，醬油中含有大量的蛋白質(zhì)、色素及脂肪，不僅影響樣品的提取，而且會(huì)造成液相色譜分離時(shí)色譜柱的堵塞，因此采取固相萃取對(duì)樣品進(jìn)行凈化[10]。本實(shí)驗(yàn)采用反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定7種防腐劑，利用二極管陣列檢測(cè)器提供的被測(cè)組分的光譜掃描圖和其相應(yīng)保留時(shí)間綜合定性鑒別，提高定性的準(zhǔn)確性，旨在為醬油中7種防腐劑的測(cè)定提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬油樣品：市場(chǎng)抽檢、石家莊市珍極釀造廠提供醬油陰性樣品。

甲醇、乙腈(均為色譜純) 迪馬公司；乙酸銨(優(yōu)級(jí)純)、冰乙酸(分析純)、磷酸(分析純)、磷酸二氫鉀(分析純)；標(biāo)準(zhǔn)品(均為色譜純)：苯甲酸、山梨酸 德國(guó)DR公司；脫氫乙酸 美國(guó)Sigma公司；對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、對(duì)羥基苯甲酸丁酯 Dikma(中國(guó))公司。

1.0 mg/mL苯甲酸、山梨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；1.0mg/mL脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；1.0mg/mL對(duì)羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.2 儀器與設(shè)備

1200超快速液相色譜儀[內(nèi)附自動(dòng)進(jìn)樣器、二元泵、二極管陣列檢測(cè)器(DAD)]、固相萃取裝置 美國(guó)Agilent公司；RT15T高速冷凍離心機(jī) 上海天美公司；AE 200萬(wàn)分之一分析天平 法國(guó)Mettler公司；KQ-250pv超聲波清洗器；移液器(1、5mL)；Oasis HLB固相萃取柱(500mg，6mL) 美國(guó)Waters公司。

1.3 色譜條件

色譜柱：Warters-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)。流動(dòng)相A為乙酸銨(20mmol/L，并調(diào)pH值至4.0)，流動(dòng)相B為乙腈。采用梯度洗脫程序詳見(jiàn)表1。流速：1.00mL/min；進(jìn)樣體積：10μL；溫度：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：230、260nm。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的確定

將標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋為10、20、40、50、80、100μg/mL，并在上述色譜條件下測(cè)定，后得到各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.5 樣品前處理及固相萃取

選取10個(gè)有代表性的醬油樣品：取1mL醬油樣品于10mL刻度離心管中，加5mL水，用氨水(1+9)調(diào)節(jié)pH7，用水定容至10mL，超聲提取30min，15000r/min離心10min，上清液經(jīng)0.22μm水相濾膜過(guò)濾后，供凈化使用。

固相萃取：取固相萃取小柱加3mL甲醇活化，再加3mL水進(jìn)行平衡，然后取處理后的樣品清液5.0mL，以1.0mL/min流速通過(guò)萃取柱，用3mL 5%甲醇-0.1%磷酸溶液清洗萃取柱，棄去清洗液。最后用1.5mL甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液，用水定容至5.0mL，用0.45μm針頭過(guò)濾器過(guò)濾，10μL進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱和流動(dòng)相洗脫條件的選擇

實(shí)驗(yàn)采用兩種色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6mm×150mm，5μm)和Warters-C18(4.6mm×250mm，5μm)進(jìn)行，通過(guò)比較其分離效果和出峰時(shí)間，最終選定后者。

采用乙酸銨和乙腈作為流動(dòng)相，分別在不同質(zhì)量濃度配比、不同pH值、不同梯度洗脫的各種條件下考察了各種因素對(duì)于目標(biāo)化合物的分離度及峰形的影響。最終采用了表1中的洗脫程序。在該條件下分離7種質(zhì)量濃度均為100mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 7種標(biāo)品在質(zhì)量濃度為100mg/L時(shí)的分離色譜圖Fig.1 Chromatogram of 7 preservative standards at the concentration of 100 mg/mL

2.2 不同組分最大吸收波長(zhǎng)的確定和檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

二極管陣列檢測(cè)器最突出的特點(diǎn)即是可提供被測(cè)組分的光譜掃描圖，在色譜過(guò)程中可同時(shí)收集被測(cè)組分的光譜信息和色譜信息，這為對(duì)于不同化合物的準(zhǔn)確定性提供了極大的方便。因此本實(shí)驗(yàn)將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全光譜范圍內(nèi)的掃描，根據(jù)光譜圖得到了各組分的最大吸收波長(zhǎng)分別為：苯甲酸224nm、山梨酸253nm、脫氫乙酸231nm，對(duì)羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯均為260nm。最終選定苯甲酸，山梨酸及脫氫乙酸的檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm；對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)的檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm。

2.3 固相萃取柱和洗脫溶劑的選擇

醬油中含有大量的醬色和蛋白質(zhì)，會(huì)造成液相色譜分離時(shí)色譜柱的堵塞，因此在進(jìn)行液相色譜分離前，必須進(jìn)行處理以保護(hù)色譜柱，保證檢測(cè)工作順利進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)采用固相萃取對(duì)醬油樣品進(jìn)行凈化，并對(duì)固相萃取柱的種類(lèi)和洗脫溶劑進(jìn)行選擇。

2.3.1 固相萃取柱的選擇

醬油提取后的溶液體積較大且含有的雜質(zhì)較多，需要進(jìn)行凈化和濃縮富集。實(shí)驗(yàn)比較在試樣中添加質(zhì)量濃度均為5.0mg/L的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按照1.5節(jié)操作，平行3次實(shí)驗(yàn)，通過(guò)平均回收率比較中性氧化鋁柱、C18柱和HLB柱3種固相萃取柱的凈化效果，結(jié)果表明，HLB的凈化效果最佳，見(jiàn)表2。

2.3.2 洗脫溶劑的選擇

表2 試樣固相萃取凈化回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果匯總表(n=3)Table 2 Effect of SPE column type on average spike recoveries of 7 preservatives (n=3)

實(shí)驗(yàn)采用HLB柱對(duì)醬油樣品進(jìn)行凈化，并對(duì)洗脫溶劑進(jìn)行考察。在5.0mg/L添加量，按照1.5節(jié)操作，平行3次實(shí)驗(yàn)，對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果。1)接取直接流過(guò)液，用水定容至5mL，測(cè)定其含量；2)接取甲醇洗脫液，用水定容至5mL，測(cè)定其含量；3)接取20%甲醇洗脫液，用水定容至5mL，測(cè)定其含量見(jiàn)表3。可見(jiàn)，用甲醇洗脫時(shí)，7種被測(cè)物均可得到很好的洗脫。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行逐級(jí)稀釋?zhuān)⑴渲瞥梢幌盗匈|(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合液，在所選定的色譜條件下，以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。方法的檢出限以RSN=3計(jì)算。各組分標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見(jiàn)表4。在0.4～100mg/L范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.9994，方法檢出限介于0.28～0.55mg/L之間。

表3 不同洗脫溶劑對(duì)回收率的影響(n=3)Table 3 Effect of elution solvent type on average spike recoveries of 7 preservatives (n=3)

表4 方法線性方程、檢出限和RSD (n=6)Table 4 Linear equations, detection limits, and relative standard deviations (n=6)

2.5 精密度和回收率實(shí)驗(yàn)

表5 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Average recoveries of 7 preservatives from a blank sample at 3 spike levels

取同一空白樣品平行試樣7份，分別添加3個(gè)水平的等量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.5節(jié)處理進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)操作3次，所得的回收率及精密度見(jiàn)表5，各個(gè)組分的回收率范圍在84.4%～102.3%之間，7種防腐劑的平均回收率為89.9%～96.5%、RSD為4.1%～6.1%，此結(jié)果令人滿(mǎn)意。

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本方法對(duì)日常監(jiān)管任務(wù)的樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示不同廠家生產(chǎn)的醬油樣品中以配制醬油中添加防腐劑種類(lèi)較多，同時(shí)在釀造醬油中也有檢出。本實(shí)驗(yàn)提到的7種防腐劑都有檢測(cè)出陽(yáng)性樣品。研究表明過(guò)量攝入防腐劑會(huì)對(duì)人體內(nèi)分泌系統(tǒng)造成危害[16]。

3 結(jié) 論

此法采用二極管陣列-反相高效液相色譜實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)醬油中苯甲酸及其鹽、山梨酸及其鹽、脫氫乙酸、對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯)7種物質(zhì)。DAD檢測(cè)器既能提供各組分物質(zhì)的色譜圖也能提供光譜圖，保證準(zhǔn)確鑒別各物質(zhì)。且測(cè)量的范圍可以滿(mǎn)足醬油中防腐劑的檢測(cè)需求，同時(shí)針對(duì)不同的食品，也可以通過(guò)改變前處理方法實(shí)現(xiàn)對(duì)于各種食品中防腐劑的測(cè)定。該方法具有針對(duì)大批樣品的檢測(cè)工作有極大的優(yōu)勢(shì)，且簡(jiǎn)單易操作，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。另外，由于實(shí)驗(yàn)安排也考慮到生物防腐劑的影響，但并未有實(shí)質(zhì)性的結(jié)果，在今后的研究工作中可將重點(diǎn)轉(zhuǎn)向此類(lèi)防腐劑與其他多種防腐劑的同時(shí)檢測(cè)。

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Simultaneous Determination of 7 Preservatives in Soy Sauce by High Performance Liquid Chromatography

XIA Jing，ZHANG Jing-xuan，LI Hui*，YANG Lan，WU Chun-min
(Key Laboratory of Food Safety of Hebei, Hebei Institute of Food Quality Supervision Inspection and Research, Shijiazhuang 050051, China)

An analytical method to simultaneously determine 7 preservatives in soy sauce such as benzoic acid, sorbic acid, dehydroacetic acid and p-hydroxybenzoic acid esters (methyl paraben, ethyl paraben, propyl paraben and butyl paraben) was established using high performance liquid chromatography. The analytes were cleaned up on Oasis HLB column and detected at 230 nm and 260 nm. Their chromatographic separation was performed on Warters-C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5μm) using acetonitrile and ammonium acetate as mobile phase for gradient elution. All the 7 preservatives displayed a linear concentrationpeak area relationship over the concentration range of 0.4-100 mg/L, with a correlation coefficient of larger than 0.9994. The limits of detection of the method were from 0.28 to 0.55μg/mL. Average spike recovery rates for the 7 preservatives in a blank sample were from 84.4% to 102.3% (n = 3). This method can be used to detect preservatives in soy sauce rapidly and conveniently. Key words：soy sauce；high performance liquid chromatography(HPLC)；preservatives

TS202.3；TS264.21

A

1002-6630(2011)14-0219-04

2010-09-24

河北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局科技項(xiàng)目(090107)

夏靜(1981—)，女，工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称诽砑觿┑臋z測(cè)技術(shù)。E-mail：xiajing0508@163.com

*通信作者：李揮(1978—)，男，工程師，博士研究生，研究方向?yàn)閮x器分析。E-mail：lihui7171@163.com