分光光度計(jì)法快速檢測(cè)果汁中嗜熱耐酸菌

葉建芳，李文俊，趙文超，莫小晶，賈彩鳳

(華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200241)

分光光度計(jì)法快速檢測(cè)果汁中嗜熱耐酸菌

葉建芳，李文俊，趙文超，莫小晶，賈彩鳳*

(華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200241)

酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)是果汁污染的主要嗜酸耐熱菌。它可以將香草酸或者香蘭素轉(zhuǎn)化為愈創(chuàng)木酚，后者在過(guò)氧化物酶的作用下產(chǎn)生紅褐色產(chǎn)物，從而可以快速檢測(cè)該菌。根據(jù)這個(gè)原理，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)探究該顏色反應(yīng)的最優(yōu)培養(yǎng)條件以及實(shí)際體系中檢測(cè)該菌的可行性。結(jié)果表明：在靜止培養(yǎng)情況下，在BAM培養(yǎng)基中添加100μg/kg的香草酸最有利于愈創(chuàng)木酚的產(chǎn)生；不同濃度的嗜熱耐酸菌芽孢液在上述條件下培養(yǎng)，隨著濃度的降低產(chǎn)生高濃度愈創(chuàng)木酚時(shí)間依次延遲，最低濃度為3個(gè)/mL的芽孢培養(yǎng)21h后，愈創(chuàng)木酚含量用分光光度計(jì)測(cè)定的光密度值OD470為1.0以上，為肉眼可見(jiàn)的紅褐色；模擬實(shí)際體系下的培養(yǎng)也出現(xiàn)了顏色反應(yīng)，證明該方法確實(shí)可以實(shí)現(xiàn)果汁中嗜熱耐酸菌的快速、簡(jiǎn)便、高靈敏度的檢測(cè)。

果汁；嗜熱耐酸菌；愈創(chuàng)木酚；分光光度計(jì)；顏色反應(yīng)

酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidoterrestris，Aa)是果汁污染的主要嗜酸耐熱菌[1]，國(guó)際貿(mào)易嚴(yán)格要求每10mL 濃縮果汁中該菌的含量不超過(guò)1個(gè)[2]。Aa超標(biāo)是濃縮果汁生產(chǎn)中最為嚴(yán)重的質(zhì)量問(wèn)題之一，是近年來(lái)濃縮果汁生產(chǎn)廠家比較棘手的問(wèn)題。該菌在常溫下能代謝產(chǎn)生一種不愉快風(fēng)味的化合物——2,6-二溴苯酚，在萬(wàn)億分之一的濃度就會(huì)使果汁口感風(fēng)味變差，甚至使其濁度升高乃至在包裝物底部形成白色沉淀的危害[3]。

傳統(tǒng)的Aa檢測(cè)方法耗時(shí)很長(zhǎng)，一般需要4～5d才能出檢測(cè)報(bào)告[4]，檢測(cè)結(jié)果的滯后性使之無(wú)法及時(shí)指導(dǎo)生產(chǎn)。用分子生物學(xué)的方法進(jìn)行檢測(cè)[5-6]，所需要的成本較高，對(duì)操作者的要求嚴(yán)格，且結(jié)果的重復(fù)性不佳，因此作為日常果汁檢測(cè)，限制了其在小型果汁廠家的應(yīng)用。生產(chǎn)中迫切需要一種快速、準(zhǔn)確的Aa檢測(cè)方法。

愈創(chuàng)木酚，化學(xué)名稱為鄰甲氧基苯酚，是一種略帶清香的物質(zhì)。愈創(chuàng)木酚在過(guò)氧化物酶的催化下可與過(guò)氧化氫反應(yīng)，生成四愈創(chuàng)醌，該物質(zhì)為紅褐色。Aa能夠代謝產(chǎn)生愈創(chuàng)木酚[7-9]，果汁中愈創(chuàng)木酚的存在可作為定性檢測(cè)Aa的依據(jù)[9-12]。本研究通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基加快菌的生長(zhǎng)，尋求最佳的產(chǎn)生愈創(chuàng)木酚的培養(yǎng)條件，并利用其顏色反應(yīng)來(lái)檢測(cè)Aa的存在。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

嗜熱耐酸菌DSM2498 德國(guó)菌種保藏中心；辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)德國(guó)Sigma公司；果汁：匯源100%不含防腐劑水果汁(A)、自制新鮮水果汁(B)；402、BAM、AAM、YSG、K氏5種[12]培養(yǎng)基；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

GNP-9160 隔水式恒溫培養(yǎng)箱、DK-S24 電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DL-CJ-2ND超凈工作臺(tái) 北京市東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；T6 新悅-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；YXQ-LS-75SII 高壓蒸汽滅菌鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TDL80-2B 臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；MDF-U32V 低溫冰箱 日本三洋電氣有限公司。

1.2 方法

1.2.1 芽孢的制備和計(jì)數(shù)

將菌種接種在402斜面上45℃培養(yǎng)1周，用5mL無(wú)菌水洗下芽孢，3500r/min離心10min，棄上清液。用無(wú)菌水復(fù)溶，重復(fù)4次，后用5mL無(wú)菌水復(fù)溶，4℃保存?zhèn)溆谩Ｓ?jì)數(shù)采用平板計(jì)數(shù)法，將上述制備的菌液于80℃水浴鍋中加熱10min，稀釋的菌液涂平板，45℃培養(yǎng)4d后計(jì)數(shù)。

1.2.2 顏色反應(yīng)

[9]設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)體系為：1mL鄰苯二甲酸氫鉀緩沖體系＋0.3mL辣根過(guò)氧化物酶(HRP)＋50μL 3% H2O2＋2mL菌上清液。

1.2.3 最佳培養(yǎng)培養(yǎng)條件的選擇

取上述芽孢原液0.1mL接入100mL AAM液體培養(yǎng)基中，在水浴鍋中80℃加熱10min，再加入1mL 100mg/mL香草酸[8]，45℃靜止或100r/min振蕩培養(yǎng)。每隔3h取樣，測(cè)定菌液的比濁度OD420。將菌液5000r/min離心5min后取上清，測(cè)定OD470的光密度值用于計(jì)算愈創(chuàng)木酚的含量。

1.2.4 香草酸和香蘭素對(duì)愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生的影響

同1.2.3節(jié)方法，向 AAM培養(yǎng)基中加入香草酸或香蘭素，45℃靜止或100r/min振蕩培養(yǎng)。不同時(shí)間取樣測(cè)定菌液的比濁度OD420，并取上清測(cè)定愈創(chuàng)木酚的含量。

1.2.5 產(chǎn)生愈創(chuàng)木酚最優(yōu)培養(yǎng)基的選擇

同1.2.3節(jié)方法，把芽孢原液接入402、BAM、YSG、K氏、AAM5種培養(yǎng)基中，再加入香草酸或香蘭素，45℃培養(yǎng)。每隔3h取樣測(cè)定菌液的比濁度OD420。并取上清測(cè)定愈創(chuàng)木酚的含量。

1.2.6 不同濃度初始菌液培養(yǎng)結(jié)果

在BAM培養(yǎng)基中添加100μg/kg的香草酸，不同初始濃度的嗜熱耐酸菌芽孢液(3×103、3×102、3× 101、3×100個(gè)/mL)在45℃恒溫箱靜止培養(yǎng)。每隔3h取樣，測(cè)定菌液的比濁度OD420，并取上清液測(cè)定愈創(chuàng)木酚的含量。

1.2.7 果汁中嗜熱耐酸菌培養(yǎng)及測(cè)定

培養(yǎng)體系：滅菌的BAM培養(yǎng)基(內(nèi)含香草酸)，每份1.8mL裝入7mL無(wú)菌EP管中。

待檢樣品制備：將嗜熱耐酸菌菌液分別用A和B果汁梯度稀釋，使芽孢的終濃度為103、102、101、100個(gè)/mL，同時(shí)用相應(yīng)果汁做空白對(duì)照，在水浴鍋中80℃加熱10min；預(yù)培養(yǎng)：培養(yǎng)體系中加入制備的待檢樣品0.2mL，45℃靜止培養(yǎng)24h；檢測(cè)：培養(yǎng)液中加入50μL H2O2溶液，1mL鄰苯二甲酸氫鉀緩沖體系，0.3mL HRP，10min后觀察顯色，并用相機(jī)拍照。

2 結(jié)果與分析

圖1 振蕩與靜止培養(yǎng)(AAM培養(yǎng)基)培養(yǎng)結(jié)果Fig.1 Effect of stationary culture and shaking culture on guaiacol production

2.1 轉(zhuǎn)速對(duì)愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生的影響如圖1所示，在進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，振蕩培養(yǎng)明顯快于靜止培養(yǎng)時(shí)菌的生長(zhǎng)速度，但是兩種條件下產(chǎn)生愈創(chuàng)木酚含量相差不大，且靜止培養(yǎng)較符合實(shí)際應(yīng)用體系，所以以下采用該培養(yǎng)條件。

2.2 香草酸和香蘭素對(duì)愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生的影響

圖2 添加香草酸(A)和香蘭素(B)對(duì)BAM培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果Fig.2 Effect of vanillic addition acid vanillin addition on guaiacol production

圖3 4種培養(yǎng)基對(duì)創(chuàng)愈木酚的影響Fig.3 Effect of different culture media on guaiacol production

如圖2所示，添加香草酸的培養(yǎng)基比添加了香蘭素的培養(yǎng)基產(chǎn)生的愈創(chuàng)木酚的量更多且速度更快，所以在以后的實(shí)驗(yàn)中采用香草酸為添加劑。

2.3 不同種類培養(yǎng)基對(duì)愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生的影響

K氏培養(yǎng)液不利于酸土菌的生長(zhǎng)，無(wú)法得到OD值；另4種培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果如圖3所示：YSG培養(yǎng)基菌生長(zhǎng)緩慢，且斜率較小；402培養(yǎng)基的靜止期長(zhǎng)；AAM培養(yǎng)液菌的靜止期較短(9h)，但菌液的最高OD420值不高，僅為1.7左右；BAM培養(yǎng)基培養(yǎng)靜止期短，愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生的指數(shù)期提前，且在12h愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生量最大達(dá)到OD4702.0，更適合做該菌檢測(cè)的培養(yǎng)基。綜合5種培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果，選定BAM培養(yǎng)基為最優(yōu)培養(yǎng)基。

2.4 不同濃度初始菌液培養(yǎng)結(jié)果

不同濃度的嗜熱耐酸菌芽孢液(3×103、3×102、3×101、3×100個(gè)/mL)在上述條件下培養(yǎng)，隨著濃度的降低產(chǎn)愈創(chuàng)木酚的時(shí)間依次延遲，最低濃度為3×100個(gè)/mL的芽孢液經(jīng)培養(yǎng)21h后得到的培養(yǎng)液，愈創(chuàng)木酚的含量用分光光度計(jì)測(cè)定的光密度值OD470為1.0以上(圖4)，為肉眼可見(jiàn)的紅褐色。

圖4 不同濃度初始菌液培養(yǎng)結(jié)果圖Fig.4 Effect of initial cell suspension density on guaiacol production

2.5 模擬試劑盒的檢測(cè)結(jié)果

以圖5、6為試劑盒簡(jiǎn)單模型和部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果(以蘋果汁為例)，左側(cè)顏色最淺的為空白對(duì)照，從左到右分別是3×103、3×102、3×101、3×100個(gè)/mL菌液的檢測(cè)結(jié)果。可以看到，所有的待檢樣品檢測(cè)都呈現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的紅褐色，證明該檢測(cè)方案確實(shí)可行。

圖5 待檢市售100%不含防腐劑蘋果汁樣品檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Detection results of commercial 100% apple juice sample without preservatives

圖6 待檢自制新鮮蘋果汁樣品檢測(cè)結(jié)果Fig.6 Detection results of home-made apple juice sample

3 討 論

3.1 設(shè)計(jì)最佳顏色反應(yīng)體系

按設(shè)計(jì)的顏色反應(yīng)體系(1mL緩沖體系＋0.3mL HRP＋50μL 3% H2O2＋2mL愈創(chuàng)木酚溶液)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到了最佳的反應(yīng)pH值和反應(yīng)時(shí)間，同時(shí)愈創(chuàng)木酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作證明了愈創(chuàng)木酚含量與吸光度之間確實(shí)存在著正相關(guān)的相關(guān)關(guān)系，為以后研究吸光度與菌液濃度之間的關(guān)系提供依據(jù)。

3.2 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

以添加香草酸的BAM培養(yǎng)基并在靜止條件下優(yōu)化培養(yǎng)，在24h內(nèi)，3×100個(gè)/mL的最小濃度嗜熱耐酸菌的愈創(chuàng)木酚產(chǎn)量也達(dá)到了OD最大值，由此，與傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法相比，上述研究結(jié)果顯示，用顏色反應(yīng)監(jiān)測(cè)嗜熱耐酸菌，把檢測(cè)該菌的時(shí)間縮短到了24h之內(nèi)，具有極大的可行性，能夠很大程度的提高工廠的實(shí)際生產(chǎn)效益。

3.3 實(shí)際檢測(cè)體系的應(yīng)用

依據(jù)設(shè)計(jì)出的檢測(cè)體系，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，確實(shí)可以達(dá)到檢測(cè)出樣品中嗜熱耐酸菌的目的，為以后的定量檢測(cè)提供了參考，也證明了該方法在實(shí)際應(yīng)用中的可行性。

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A Rapid Spectrometric Method for Detecting Alicyclobacillus acidoterrestris in Fruit Juice

YE Jian-fang，LI Wen-jun，ZHAO Wen-chao，MO Xiao-jing，JIA Cai-feng*
(School of Life Science, East China Normal University, Shanghai 200241, China)

In the presence of Alicyclobacillus acidoterrestris, vanillic acid and vanillin can be converted into guaiacol, which can be further converted into a reddish-brown product by peroxidase. Based on this color reaction, a method was developed to spectrometrically detect the presence of Alicyclobacillus acidoterrestris in real systems. In static culture, BAM medium with the addition of 100μg/kg vanillic acid was the most favorable for guaiacol formation. The peak value of guaiacol concentration was delayed along with the decrease of bacteria concentration. A visible color was formed in medium and its OD470 could reach up to 1.0 or even more after 21 hours of culture at the initial spore density of 3 spores/mL. And the same result also was obtained in an apple juice system. Thus, this method can allow rapid, simple and sensitive detection of Alicyclobacillus acidoterrestris in fruit juice.

juice；Alicyclobacillus acidoterrestris；guaiacol；spectrophotometer；color reaction

Q935

A

1002-6630(2011)14-0241-04

2010-11-02

上海市大學(xué)生創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目(KY2009-12S)

葉建芳(1990—)，女，本科生，研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)。E-mail：wzaybh@yahoo.com

*通信作者：賈彩鳳(1979—)，女，工程師，博士研究生，研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)。E-mail：cfjia@bio.ecnu.edu.cn