分光光度計法快速檢測果汁中嗜熱耐酸菌

葉建芳，李文俊，趙文超，莫小晶，賈彩鳳

(華東師范大學生命科學學院，上海 200241)

分光光度計法快速檢測果汁中嗜熱耐酸菌

葉建芳，李文俊，趙文超，莫小晶，賈彩鳳*

(華東師范大學生命科學學院，上海 200241)

酸土脂環酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)是果汁污染的主要嗜酸耐熱菌。它可以將香草酸或者香蘭素轉化為愈創木酚，后者在過氧化物酶的作用下產生紅褐色產物，從而可以快速檢測該菌。根據這個原理，設計實驗探究該顏色反應的最優培養條件以及實際體系中檢測該菌的可行性。結果表明：在靜止培養情況下，在BAM培養基中添加100μg/kg的香草酸最有利于愈創木酚的產生；不同濃度的嗜熱耐酸菌芽孢液在上述條件下培養，隨著濃度的降低產生高濃度愈創木酚時間依次延遲，最低濃度為3個/mL的芽孢培養21h后，愈創木酚含量用分光光度計測定的光密度值OD470為1.0以上，為肉眼可見的紅褐色；模擬實際體系下的培養也出現了顏色反應，證明該方法確實可以實現果汁中嗜熱耐酸菌的快速、簡便、高靈敏度的檢測。

果汁；嗜熱耐酸菌；愈創木酚；分光光度計；顏色反應

酸土脂環酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidoterrestris，Aa)是果汁污染的主要嗜酸耐熱菌[1]，國際貿易嚴格要求每10mL 濃縮果汁中該菌的含量不超過1個[2]。Aa超標是濃縮果汁生產中最為嚴重的質量問題之一，是近年來濃縮果汁生產廠家比較棘手的問題。該菌在常溫下能代謝產生一種不愉快風味的化合物——2,6-二溴苯酚，在萬億分之一的濃度就會使果汁口感風味變差，甚至使其濁度升高乃至在包裝物底部形成白色沉淀的危害[3]。

傳統的Aa檢測方法耗時很長，一般需要4～5d才能出檢測報告[4]，檢測結果的滯后性使之無法及時指導生產。用分子生物學的方法進行檢測[5-6]，所需要的成本較高，對操作者的要求嚴格，且結果的重復性不佳，因此作為日常果汁檢測，限制了其在小型果汁廠家的應用。生產中迫切需要一種快速、準確的Aa檢測方法。

愈創木酚，化學名稱為鄰甲氧基苯酚，是一種略帶清香的物質。愈創木酚在過氧化物酶的催化下可與過氧化氫反應，生成四愈創醌，該物質為紅褐色。Aa能夠代謝產生愈創木酚[7-9]，果汁中愈創木酚的存在可作為定性檢測Aa的依據[9-12]。本研究通過優化培養基加快菌的生長，尋求最佳的產生愈創木酚的培養條件，并利用其顏色反應來檢測Aa的存在。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

嗜熱耐酸菌DSM2498 德國菌種保藏中心；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)德國Sigma公司；果汁：匯源100%不含防腐劑水果汁(A)、自制新鮮水果汁(B)；402、BAM、AAM、YSG、K氏5種[12]培養基；其他試劑均為國產分析純。

GNP-9160 隔水式恒溫培養箱、DK-S24 電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司；DL-CJ-2ND超凈工作臺 北京市東聯哈爾儀器制造有限公司；T6 新悅-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；YXQ-LS-75SII 高壓蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；TDL80-2B 臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；MDF-U32V 低溫冰箱 日本三洋電氣有限公司。

1.2 方法

1.2.1 芽孢的制備和計數

將菌種接種在402斜面上45℃培養1周，用5mL無菌水洗下芽孢，3500r/min離心10min，棄上清液。用無菌水復溶，重復4次，后用5mL無菌水復溶，4℃保存備用。計數采用平板計數法，將上述制備的菌液于80℃水浴鍋中加熱10min，稀釋的菌液涂平板，45℃培養4d后計數。

1.2.2 顏色反應

[9]設計實驗的反應體系為：1mL鄰苯二甲酸氫鉀緩沖體系＋0.3mL辣根過氧化物酶(HRP)＋50μL 3% H2O2＋2mL菌上清液。

1.2.3 最佳培養培養條件的選擇

取上述芽孢原液0.1mL接入100mL AAM液體培養基中，在水浴鍋中80℃加熱10min，再加入1mL 100mg/mL香草酸[8]，45℃靜止或100r/min振蕩培養。每隔3h取樣，測定菌液的比濁度OD420。將菌液5000r/min離心5min后取上清，測定OD470的光密度值用于計算愈創木酚的含量。

1.2.4 香草酸和香蘭素對愈創木酚產生的影響

同1.2.3節方法，向 AAM培養基中加入香草酸或香蘭素，45℃靜止或100r/min振蕩培養。不同時間取樣測定菌液的比濁度OD420，并取上清測定愈創木酚的含量。

1.2.5 產生愈創木酚最優培養基的選擇

同1.2.3節方法，把芽孢原液接入402、BAM、YSG、K氏、AAM5種培養基中，再加入香草酸或香蘭素，45℃培養。每隔3h取樣測定菌液的比濁度OD420。并取上清測定愈創木酚的含量。

1.2.6 不同濃度初始菌液培養結果

在BAM培養基中添加100μg/kg的香草酸，不同初始濃度的嗜熱耐酸菌芽孢液(3×103、3×102、3× 101、3×100個/mL)在45℃恒溫箱靜止培養。每隔3h取樣，測定菌液的比濁度OD420，并取上清液測定愈創木酚的含量。

1.2.7 果汁中嗜熱耐酸菌培養及測定

培養體系：滅菌的BAM培養基(內含香草酸)，每份1.8mL裝入7mL無菌EP管中。

待檢樣品制備：將嗜熱耐酸菌菌液分別用A和B果汁梯度稀釋，使芽孢的終濃度為103、102、101、100個/mL，同時用相應果汁做空白對照，在水浴鍋中80℃加熱10min；預培養：培養體系中加入制備的待檢樣品0.2mL，45℃靜止培養24h；檢測：培養液中加入50μL H2O2溶液，1mL鄰苯二甲酸氫鉀緩沖體系，0.3mL HRP，10min后觀察顯色，并用相機拍照。

2 結果與分析

圖1 振蕩與靜止培養(AAM培養基)培養結果Fig.1 Effect of stationary culture and shaking culture on guaiacol production

2.1 轉速對愈創木酚產生的影響如圖1所示，在進行培養時，振蕩培養明顯快于靜止培養時菌的生長速度，但是兩種條件下產生愈創木酚含量相差不大，且靜止培養較符合實際應用體系，所以以下采用該培養條件。

2.2 香草酸和香蘭素對愈創木酚產生的影響

圖2 添加香草酸(A)和香蘭素(B)對BAM培養基培養結果Fig.2 Effect of vanillic addition acid vanillin addition on guaiacol production

圖3 4種培養基對創愈木酚的影響Fig.3 Effect of different culture media on guaiacol production

如圖2所示，添加香草酸的培養基比添加了香蘭素的培養基產生的愈創木酚的量更多且速度更快，所以在以后的實驗中采用香草酸為添加劑。

2.3 不同種類培養基對愈創木酚產生的影響

K氏培養液不利于酸土菌的生長，無法得到OD值；另4種培養基培養結果如圖3所示：YSG培養基菌生長緩慢，且斜率較小；402培養基的靜止期長；AAM培養液菌的靜止期較短(9h)，但菌液的最高OD420值不高，僅為1.7左右；BAM培養基培養靜止期短，愈創木酚產生的指數期提前，且在12h愈創木酚產生量最大達到OD4702.0，更適合做該菌檢測的培養基。綜合5種培養基的培養效果，選定BAM培養基為最優培養基。

2.4 不同濃度初始菌液培養結果

不同濃度的嗜熱耐酸菌芽孢液(3×103、3×102、3×101、3×100個/mL)在上述條件下培養，隨著濃度的降低產愈創木酚的時間依次延遲，最低濃度為3×100個/mL的芽孢液經培養21h后得到的培養液，愈創木酚的含量用分光光度計測定的光密度值OD470為1.0以上(圖4)，為肉眼可見的紅褐色。

圖4 不同濃度初始菌液培養結果圖Fig.4 Effect of initial cell suspension density on guaiacol production

2.5 模擬試劑盒的檢測結果

以圖5、6為試劑盒簡單模型和部分實驗結果(以蘋果汁為例)，左側顏色最淺的為空白對照，從左到右分別是3×103、3×102、3×101、3×100個/mL菌液的檢測結果。可以看到，所有的待檢樣品檢測都呈現肉眼可見的紅褐色，證明該檢測方案確實可行。

圖5 待檢市售100%不含防腐劑蘋果汁樣品檢測結果Fig.5 Detection results of commercial 100% apple juice sample without preservatives

圖6 待檢自制新鮮蘋果汁樣品檢測結果Fig.6 Detection results of home-made apple juice sample

3 討 論

3.1 設計最佳顏色反應體系

按設計的顏色反應體系(1mL緩沖體系＋0.3mL HRP＋50μL 3% H2O2＋2mL愈創木酚溶液)進行實驗，得到了最佳的反應pH值和反應時間，同時愈創木酚標準曲線的制作證明了愈創木酚含量與吸光度之間確實存在著正相關的相關關系，為以后研究吸光度與菌液濃度之間的關系提供依據。

3.2 培養條件的優化

以添加香草酸的BAM培養基并在靜止條件下優化培養，在24h內，3×100個/mL的最小濃度嗜熱耐酸菌的愈創木酚產量也達到了OD最大值，由此，與傳統的平板培養法相比，上述研究結果顯示，用顏色反應監測嗜熱耐酸菌，把檢測該菌的時間縮短到了24h之內，具有極大的可行性，能夠很大程度的提高工廠的實際生產效益。

3.3 實際檢測體系的應用

依據設計出的檢測體系，經過實驗驗證，確實可以達到檢測出樣品中嗜熱耐酸菌的目的，為以后的定量檢測提供了參考，也證明了該方法在實際應用中的可行性。

參考文獻：

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[9]BAHCECI K S, ACAR J. Determination of guaiacol produced by Alicyclobacillus acidoterrestris in apple juice by using HPLC and spectrophotometric methods, and mathematical modeling of guaiacol production[J]. Eur Food Res Technol, 2007, 225(5/6)∶ 873-878.

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A Rapid Spectrometric Method for Detecting Alicyclobacillus acidoterrestris in Fruit Juice

YE Jian-fang，LI Wen-jun，ZHAO Wen-chao，MO Xiao-jing，JIA Cai-feng*
(School of Life Science, East China Normal University, Shanghai 200241, China)

In the presence of Alicyclobacillus acidoterrestris, vanillic acid and vanillin can be converted into guaiacol, which can be further converted into a reddish-brown product by peroxidase. Based on this color reaction, a method was developed to spectrometrically detect the presence of Alicyclobacillus acidoterrestris in real systems. In static culture, BAM medium with the addition of 100μg/kg vanillic acid was the most favorable for guaiacol formation. The peak value of guaiacol concentration was delayed along with the decrease of bacteria concentration. A visible color was formed in medium and its OD470 could reach up to 1.0 or even more after 21 hours of culture at the initial spore density of 3 spores/mL. And the same result also was obtained in an apple juice system. Thus, this method can allow rapid, simple and sensitive detection of Alicyclobacillus acidoterrestris in fruit juice.

juice；Alicyclobacillus acidoterrestris；guaiacol；spectrophotometer；color reaction

Q935

A

1002-6630(2011)14-0241-04

2010-11-02

上海市大學生創新活動計劃項目(KY2009-12S)

葉建芳(1990—)，女，本科生，研究方向為微生物學。E-mail：wzaybh@yahoo.com

*通信作者：賈彩鳳(1979—)，女，工程師，博士研究生，研究方向為微生物學。E-mail：cfjia@bio.ecnu.edu.cn