豬肉乳化香腸中大豆分離蛋白的檢測

楊 勇，周小平，秦 丹，程 燕

(四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014)

豬肉乳化香腸中大豆分離蛋白的檢測

楊 勇，周小平，秦 丹，程 燕

(四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014)

通過聚丙烯酰胺凝膠電泳法(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳檢測豬肉乳化香腸中的大豆分離蛋白(soybean protein isolate，SPI)。結果顯示，大豆蛋白主要有5條蛋白條帶(β-大豆伴球蛋白中的d1、α'、β、d2亞基和大豆球蛋白的d3亞基) 能和豬肉的蛋白條帶區分開；其中，獲得了由α'亞基蛋白條帶的光強度值與SPI質量分數計算得到的一個線性回歸方程，該方程作為檢測豬肉乳化香腸中SPI添加量(0.5%～10%)的標準曲線。應用得到的標準曲線預測已知SPI質量分數(7%、3%、1.5%、0.8%、0.5%)的豬肉乳化香腸，結果證明該方法具有很好的重復性(變異系數1.90%～7.01%)。同時將SPI質量分數的預測值和真實值進行線性回歸分析，得到相關系數為0.98，證明了這種檢測方法能應用于豬肉乳化香腸中大豆分離蛋白的定量檢測。

豬肉乳化香腸；大豆分離蛋白；檢測；聚丙烯酰胺凝膠電泳

豬肉乳化香腸是近年來國內市場上具有典型代表性的西式肉制品，如法蘭克福香腸、維也納香腸、斯特拉斯堡早餐腸等。國內生產的乳化香腸主要采用豬肉為原料，輔之以食鹽、腌制劑、調味料、大豆分離蛋白等，并經過斬拌(乳化)、干燥、煙熏、蒸煮等工藝而制得，因其肉質鮮嫩、營養豐富、食用方便等特點，深受廣大消費者的歡迎[1-2]。然而，到目前為止，國內外對肉制品中大豆蛋白的檢測還沒有確定的法定方法。而一些生產商為了獲得更多的經濟利益，在肉制品中加入過多價格較低的大豆蛋白來的減少肉的添加量，且不在成分表中說明其含量，這種行為不僅導致商家不公平競爭，同時，對于消費者來說也不能基于其成分做出購買選擇[3-6]。因此，許多國家禁止添加大豆蛋白或者只允許有限度的添加大豆蛋白，如美國法律規定在香腸中大豆分離蛋白(soybean protein isolate，SPI)含量不能超過2%[7]。但目前國內在肉制品中大豆蛋白應用方面還沒有頒布相關規范，也未制定相關標準，因此，開發快速、簡便、穩定性強的大豆蛋白檢測方法，對于規范大豆蛋白的使用，保障消費者利益具有重要意義[6]。

目前國外檢測肉制品中大豆蛋白的檢測方法主要有ELISA法、高效液相色譜法、電泳法等。ELISA法是目前實驗室常用于大豆蛋白檢測的方法，但美國化學分析協會只是將它作為一種半定量的方法[8]。高效液相色譜法是一種分離蛋白質的常用方法，然而，應用該方法在分離檢測肉制品中大豆蛋白時，操作復雜且成本較高[7]。聚丙烯酰胺凝膠電泳法(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)是研究大豆蛋白最普遍的電泳方法，該方法的優點在于食品的處理過程(特別是熱處理)對檢測影響很小[9]。Molander[10]應用SDS-PAGE電泳法檢測肉制品中大豆蛋白的含量，檢出限達0.6%；Lee等[11]成功通過SDS-PAGE電泳法檢測了肉和大豆蛋白混合物(未加熱和加熱處理)中大豆蛋白的含量。然而，這種方法目前還沒有應用到檢測乳化香腸中的大豆分離蛋白。因此，本研究利用SDS-PAGE電泳法對豬肉乳化香腸中的大豆分離蛋白進行分析檢測，目的是將SDS-PAGE用于豬肉乳化香腸中大豆分離蛋白的定量檢測，并確定其檢出范圍及檢出限。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白 山東德州大王集團蛋白食品有限公司；豬后腿肉、豬脂肪、淀粉、食鹽、白沙糖、葡萄糖、味精、白胡椒粉、十三香 雅安當地超市；異VC鈉、紅曲色素、磷酸鹽、亞硝酸鈉 食品添加劑市場；豬腸衣 自備。

1.2 儀器與設備

HWS24電熱恒溫水浴鍋、DHG29345A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒公司；QT-2旋渦混合器 上海琪特分析儀器有限公司；Mini垂直電泳儀、ChemiDoc XRS凝膠成像儀 美國Bio-rad公司；Bellitouron 53200高速冷凍離心機 法國Thermo Electron公司；DSHZ-300多用途水浴恒溫振蕩器 江蘇太倉市實驗設備廠；BCD2186E1B海爾冰箱；PB210 pH計 德國賽多利斯公司。

1.3 方法

1.3.1 豬肉乳化香腸配方及加工工藝[12]

主料(質量分數)：豬后腿瘦肉(50%)、按SPI(10%、5%、2%、1%、0.5%、0%)制備用于檢測SPI的標準曲線的豬肉乳化香腸；同時按SPI(7%、3%、1.5%、0.8%、0.5%)制備用于驗證該方法的豬肉乳化香腸。

配料(質量分數)：豬脂肪(18%)、碎冰(19%)、淀粉(2%)、水(1%)、食鹽(1.9%)、白沙糖(0.5%)、葡萄糖(0.5%)、味精(0.15%)、磷酸鹽(0.3%)、亞硝酸鈉(0.015%)、白胡椒粉(0.015%)、十三香(0.01%)、異VC鈉(0.03%)、紅曲色素(0.0007%)。

工藝流程：原料豬后腿肉→選修→加SPI、配料進行斬拌、乳化→灌腸→40℃干燥 5 min→55℃干燥10min→80℃蒸煮30min→噴淋冷卻 →冷藏。

1.3.2 樣品處理

參考 Guy等[13]和王振宇等[14]的方法稍作修改，稱取豬后腿瘦肉、大豆分離蛋白、配料、不同SPI的自制豬肉乳化香腸各10.00g，研磨均勻，分別取1.00、0.20、0.80、2.00g，放入不同編號的50mL離心管中，再各添加30mL緩沖液(緩沖液由8mol尿素和10g硫基乙醇加蒸餾水至1L配制而成)，用玻璃棒攪拌均勻，旋渦混合器混合3min，4℃，10000×g離心20min， 上清液用whatman 1#濾紙在4℃條件下過濾除去上浮脂肪，濾液為蛋白提取液。

1.3.3 SDS-PAGE凝膠電泳

參考LaemmLi等[15]和Molander[10]的方法，按分離膠11%，濃縮膠4%進行SDS-PAGE凝膠電泳。

1.3.4 定量檢測

電泳完成后，用考馬斯亮藍染色液染色30min，取100mL脫色液對分離膠脫色，重復脫色3次，在600nm波長處進行掃描，用光強度的值來定量檢測大豆蛋白條帶[10,16]。

1.3.5 數據統計分析

以上實驗均重復3次。采用Quantity one軟件對凝膠結果進行分析，Origin 8.0制圖，SPSS 18.0對結果進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 定性分析豬肉乳化香腸中的大豆分離蛋白和豬肉蛋白

圖1 無配料含不同SPI添加量的模擬豬肉乳化香腸SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE patterns of pork, soybean, auxiliary materials for emulsion-type pork sausages and mimic emulsion-type pork sausages containing different amounts of SPI and no auxiliary materials

圖2 含不同SPI添加量的豬肉乳化香腸的SDS-PAGE圖Fig.2 SDS-PAGE patterns of pork, soybean, auxiliary materials for emulsion-type pork sausages and emulsion-type pork sausages containing different amounts of SPI and auxiliary materials

圖1、2顯示了豬肉、SPI、配料及SPI質量分數不同的豬肉乳化香腸的SDS-PAGE電泳圖。從圖1、2可以看出，大豆分離蛋白主要有5條(d1，α'，β，d2，d3)蛋白條帶能和豬肉的蛋白條帶區分開，但d1和d2兩條蛋白帶由于含量較低，在大豆分離蛋白質量分數為1%時不能被檢測到。5條大豆分離蛋白區分帶中有3條(α'、β、d3)蛋白條帶與Molander[10]發現的一致。大豆蛋白中的β-大豆伴球蛋白(7S)和大豆球蛋白(11S)是大豆貯藏蛋白中的兩種主要蛋白質，其含量大約分別占大豆貯藏蛋白的40%和25%[17]。圖1中α'、β為β-大豆伴球蛋白(7S)的兩個亞基，分子質量分別為82kD和48kD，d3為大豆球蛋白(11S)的一種亞基，分子質量為19kD。Lee[18]等研究指出了19.5kD的大豆蛋白條帶不會被其他多種非肉蛋白(牛奶蛋白、花生蛋白、雞蛋蛋白等)干擾，和本研究中發現的d3(19kD)蛋白條帶一致。同時從圖1和圖2還可以看到，豬肉蛋白條帶中主要有7條(r1～r7)蛋白條帶和大豆蛋白條帶區分開，其中一條45kD的豬肉蛋白條帶(G-肌動蛋白)與Hofmann[19]研究的結果一致，同時發現這條蛋白在加工前后仍大量存在，但有明顯的降低，這與王振宇[14]研究的純豬肉在80℃條件下加熱幾乎未降解存在差異，可能是由于本實驗中蛋白含量比較低，降解較明顯。從圖1、2還發現了一條接近24kD的肌鈣蛋白(r5)，這與Chen等[20]發現的24kD熱穩定蛋白一致，據研究這種蛋白在126℃加熱120min幾乎不分解，同時對其溶解度和免疫學功能均無影響。

2.2 定量分析豬肉乳化香腸中的大豆分離蛋白

由于蛋白的量與所吸附的考馬斯亮藍大致呈正比，遵循Beer-Lambert定律[21]，同時，根據Molander[10]和Lee等[11]的研究，在一定濃度范圍內，同一蛋白條帶的光強度值和大豆蛋白添加量之間存在線性關系，通過比較其相關系數，可以得到檢測大豆分離蛋白的標準曲線。由圖1、2可以發現，在大豆分離蛋白區分帶中，3條(α'、β、d3)蛋白條帶在SPI質量分數為0.5%～10%之間都能被很好的檢測到。比較由這三條(α'、β、d3)蛋白條帶的光強度值隨SPI質量分數增加的變化(圖3)，可以發現當SPI質量分數在0.5%～10%時，α'、β蛋白條帶的光強度值隨SPI質量分數的增加呈較好的線性(圖3)，而當SPI質量分數在5%～10%時，d3蛋白條帶的光強度值隨SPI質量分數的增加逐漸趨于水平(圖3)。為了得到定量分析豬肉乳化香腸中SPI的標準曲線，分別計算3條蛋白條帶(α'、β、d3)的光強度值與SPI質量分數之間的線性相關系數，得到的相關系數分別為0.9868、0.9789、0.8333。由于α'亞基蛋白條帶(線性R2=0.9868)線性相關系數最好，因此作為檢測豬肉乳化香腸中大豆分離蛋白的標準曲線(圖4)，應用SPSS 18.0分析得到標準曲線方程為Y峰面積=99.0291X＋618.5902，Y峰面積為α'亞基蛋白條帶的光強度值，χ為豬肉乳化香腸中SPI的質量分數。

圖3 不同SPI添加量的豬肉乳化香腸中蛋白條帶的光強度圖(n=3)Fig.3 SDS-PAGE band intensities of β-conglycinin α＇ andβ subunits and glycinin d3subunit versus SPI amount (n=3)

圖4 由α＇亞基計算得到的檢測SPI質量分數的標準曲線圖(n=3)Fig.4 Standard curve for the determination of SPI by regression analysis based on α' subunit

2.3 檢測大豆分離蛋白的添加量

為了驗證該標準曲線能否用于定量檢測豬肉乳化香腸中的SPI，通過由α'亞基蛋白條帶計算得到的(SPI質量分數在0.5%～10%之間)檢測豬肉乳化香腸中SPI的標準曲線(圖4)來預測未知樣品中的SPI的質量分數(圖2中5～9泳道，圖4)。表1展示了樣品中SPI質量分數的真實值和預測值，結果表明，預測的SPI質量分數接近真實SPI質量分數，低變異系數(1.90%～7.01%)證明該方法具有很好的重復性。

表1 豬肉乳化香腸中大豆分離蛋白的真實值和由標準曲線得到的預測值Table 1 Predicted and actual values of SPI in emulsion-type pork sausages

圖5 大豆分離蛋白質量分數的預測值和真實值之間的回歸分析Fig.5 Regression analysis between predicted values and actual values of SPI

設定置信區間為95.0%，對大豆分離蛋白質量分數的預測值和真實值進行線性回歸分析[22]。圖5顯示了預測值和真實值之間的相關系數為0.98，非常接近1，這就說明了預測值和真實值之間非常的接近。通過這些結果，證明了這種檢測方法能應用于豬肉乳化香腸中大豆分離蛋白的定量檢測。

3 結 論

本研究應用SDS-PAGE電泳對豬肉乳化香腸中豬肉和大豆分離蛋白進行分析檢測，獲得了一條能定量檢測豬肉乳化香腸中大豆分離蛋白(0.5%～10%)的標準曲線，其最低檢出限為0.5%。通過該標準曲線成功用于豬肉乳化香腸中大豆分離蛋白的預測，證明該方法能被有效地應用于豬肉乳化香腸中大豆分離蛋白的檢測。

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Determination of Soybean Protein Isolate in Emulsion-type Pork Sausages

YANG Yong，ZHOU Xiao-ping，QIN Dan，CHENG Yan
(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was used for the qualitative and quantitative analysis of soybean protein isolate (SPI) in emulsion-type pork sausages. Results showed that SPI displayed five major bands including β-conglycinin d1, α', β and d2subunits and glycinin d3 subunit in SDS-PAGE, which could be distinguished from pork protein. A linear regression equation with band intensity as a function of SPI concentration of α' subunit in the range of 0.5%-10% was obtained for determining SPI in emulsion-type pork sausages. The prediction values of samples containing SPI at various amounts of 7%, 3%, 1.5%, 0.8% and 0.5% exhibited a high reproducibility with variation coefficients between 1.90% and 7.01%. The successful application of SDS-PAGE was also demonstrated by a high correlation coefficient of 0.98 obtained from regression analysis between the predicted and actual values of SPI in spiked emulsion-type pork sausages.

emulsion-type pork sausages；soybean protein isolate；determination；sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)

TS251.7

A

1002-6630(2011)14-0281-04

2010-10-21

四川農業大學“雙支計劃”課題(06070105)

楊勇(1969—)，男，副教授，博士，研究方向為肉品科學與技術。E-mail：yangyong676@163.com